秦皮乙素誘導人肝癌細胞SMMC-7721凋亡的機制研究

王 晶， 偉忠民

(遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧錦州121000)

秦皮乙素是從植物秦皮中提取、分離出來的一種內酯類化合物［1］，是秦皮的主要有效成分之一，具有抗菌、消炎、鎮痛等藥理作用［2］。近年研究顯示，秦皮乙素還具有抗腫瘤作用，有報道顯示秦皮乙素對胸部腫瘤及人類白血病細胞均具有明顯抑制作用［3-4］。本課題的前期研究表明，秦皮乙素可抑制人肝癌細胞SMMC-7721的生長。但有關秦皮乙素對人肝癌細胞作用機制的研究卻罕見報道。為此本實驗探討了秦皮乙素對人肝癌細胞的促凋亡作用及機制，為臨床更好地開發利用秦皮乙素提供理論依據與實驗基礎。

1 實驗材料

1.1 細胞株 人肝癌細胞SMMC-7721購自遼寧醫學院科學實驗中心。

1.2 藥物 秦皮乙素 (購自中國藥品生物制品檢定所，批號:110741-200506);5-氟脲嘧啶 (5-Fu)(天津金耀氨基酸藥業，10 mL含0.25 g。批號:20101205);兔抗人 Bax抗體 (SANTA CRUZ公司，型號:SC-526);兔抗人Bcl-2抗體 (SANTA CRUZ公司，型號:SC-429);兔抗人Caspase-9抗體 (博奧森公司，型號:BS-0049R);兔抗人Caspase-3抗體 (博奧森公司，型號:BS-0081R)。

1.3 試劑 Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9活性檢測試劑盒 (碧云天生物技術研究所);線粒體膜電位檢測試劑盒 (JC-1)(碧云天生物技術研究所);胰蛋白酶 (Hyclone公司);小牛血清 (杭州四季清生物制品公司);DMEM培養基干粉 (GIBCO公司)。其它試劑為國產分析純。

1.4 儀器 熒光顯微鏡 (LEICACTR4000，德國);XD-101型倒置顯微鏡 (OLYMPUS TOKYO JAPAN);流式細胞儀 (BD FACSCaLibur);凝膠成像儀 (美國BIORAD);超凈工作臺 (江蘇吳縣市凈化技術研究所);二氧化碳培養箱 (Sheldon Manufacturing IncUSA);酶標儀 (9602A北京普朗)，IBO X600活體成像系統 (USA)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 人肝癌細胞SMMC-7721在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液中，37℃，5%CO2傳代培養，每2～3天換液1次，取對數生長期細胞進行實驗［5］。

2.2 JC-1染色檢測SMMC-7721細胞線粒體膜電位對數生長期細胞經秦皮乙素低劑量組 (1.12 mmol/L)，中劑量組 (2.24 mmol/L)，高劑量組(4.48mmol/L)培 養 24h，以 5-Fu(0.77 mmol/L)為陽性對照組，以PBS為陰性對照組。

SMMC-7721細胞密度約為1×106·mL－1，收集細胞，用PBS洗細胞1次，加入0.5 mL DMEM培養液和0.5 mL JC-1染色工作液，顛倒數次混勻，細胞培養箱中37℃孵育20 min。孵育結束后，600 r/min離心4 min，沉淀細胞，去上清。用JC-1染色工作液 (1×)洗滌兩次，再用0.5 mL JC-1染色工作液 (1×)重懸后，流式細胞儀檢測。實驗重復3次。用綠色熒光細胞百分率表示線粒體膜電位的降低［6］。

2.3 分光光度法檢測SMMC-7721細胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性 細胞分組同2.2項。細胞培養24 h后，用0.25%胰酶消化，收集細胞。PBS洗1次，吸盡上清。加入50 μL裂解液冰浴裂解30 min，12000 r/min，4℃離心10 min，小心吸上清至冰浴預冷的離心管中。然后在96孔板中每孔加入檢測緩沖液70 μL，待測樣品20 μL，底物Ac-IETD-ρNA 10 μL，混勻，37 ℃ 孵育 120 min。酶標儀在405 nm處測定吸光值。通過制作ρNA標準曲線，計算Caspase活化程度。每一試驗重復3次以上。

2.4 蛋白印跡法 (Western blot)法檢測SMMC-7721細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-9蛋白的表達收集5-Fu陽性對照組和PBS陰性對照組及秦皮乙素各濃度組 ［秦皮乙素低劑量組 (1.12 mmol/L)，中劑量組 (2.24 mmol/L)，高劑量組 (4.48 mmol/L和8.96 mmol/L)］，處理24 h的細胞，用冷PBS洗2次，加入裂解液于4℃裂解30 min，4℃12500 r/min離心5 min，收集上清并測定蛋白濃度。用10%SDS-PAGE分離蛋白，電泳后將蛋白轉至硝酸纖維素膜上。加入1∶1000稀釋一抗，4℃過夜，洗膜。再加入1∶1000稀釋的二抗孵育1 h，然后洗膜3次。內參照采用β-actin，顯色，照相。

2.5 免疫熒光法檢測 Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表達 蓋玻片使用實驗室常規防脫片處理方法處理，六孔板做細胞爬片。取對數生長期細胞經秦皮乙素低劑量組 (1.12 mmol/L)，中劑量組 (2.24 mmol/L)，高劑量組 (4.48 mmol/L)培養，以5-Fu(0.77 mmol/L)為陽性對照組，以PBS為陰性對照組。培養24 h后，10%福爾馬林固定30 min，PBS洗3次，30%H2O2和甲醇混合，室溫浸泡15 min，蒸餾水洗3次，滴加3%BSA封閉液25 min，加入1∶500稀釋的一抗，4℃過夜。PBS洗3次，加入1∶200稀釋的二抗，37℃避光孵育20 min，PBS洗3次。封片，熒光顯微鏡下觀察。

2.6 統計學處理 用SPSS17.0統計軟件進行分析，計量資料以均值±標準差表示。P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 JC-1染色檢測人肝癌細胞SMMC-7721線粒體膜電位 JC-1是一種熒光探針，當線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質中，形成聚合物，產生紅色熒光;當線粒體膜電位較低時，JC-1為單體，產生綠色熒光。故可通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化。結果見表1，圖1。結果表明隨著秦皮乙素濃度的增加，細胞線粒體膜電位下降，且呈劑量依賴性。與對照組比較差異顯著 (P＜0.05)。

表1 秦皮乙素對人肝癌細胞SMMC-7721線粒體膜電位降低的影響 (n=5，±s)Tab.1 Aesculetin effects on reducing mitochondrial membrane potential of human hepatoma SMMC-7721(n=5，±s)

表1 秦皮乙素對人肝癌細胞SMMC-7721線粒體膜電位降低的影響 (n=5，±s)Tab.1 Aesculetin effects on reducing mitochondrial membrane potential of human hepatoma SMMC-7721(n=5，±s)

注:與對照組相比，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組 別 線粒體膜電位/%0.07±0.045-Fu 0.77 mmol/L組 25.74±0.16★秦皮乙素1.12 mmol/L組 16.96±0.29★秦皮乙素2.24 mmol/L組 35.81±0.27★★秦皮乙素4.48 mmol/L組 47.15±0.13陰性對照組★★

圖1 秦皮乙素對人肝癌細胞SMMC-7721線粒體膜電位的影響 (n=5)Fig.1 Effect of aesculetin on mitochondrial membrane potential in human hepatoma SMMC-7721(n=5)

3.2 秦皮乙素對人肝癌細胞SMMC-7721 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性的影響 秦皮乙素(1.12、2.24、4.48 mmol/L)作用人肝癌細胞SMMC-7721細胞24 h后，Caspase-3、Caspase-9活性升高，并呈劑量依賴性。與對照組比較差異有統計學意義，P＜0.05。Caspase-8活性基本無變化。結果見表2。

表2 秦皮乙素對人肝癌細胞SMMC-7721Caspase活性的影響 (n=5，±s)Tab.2 Effects of aesculetin on Caspase activity in human hepatoma SMMC-7721(n=5，±s)

表2 秦皮乙素對人肝癌細胞SMMC-7721Caspase活性的影響 (n=5，±s)Tab.2 Effects of aesculetin on Caspase activity in human hepatoma SMMC-7721(n=5，±s)

注:與對照比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

6.86 ±0.15 5.93 ±0.15 22.23 ±0.125-Fu 0.77 mmol/L 組 23.62 ±9.49* 26.63 ±16.11* 29.87 ±6.33*活性陰性對照組組 別 Caspase3活性 Caspase9活性 Caspase8秦皮乙素1.12 mmol/L 組 25.20 ±13.35* 34.59 ±13.54* 50.84 ±7.05*秦皮乙素2.24 mmol/L 組 47.93 ±15.33＊＊ 49.15 ±12.95＊＊ 48.89 ±7.73＊＊秦皮乙素4.48 mmol/L 組 75.73 ±12.87＊＊ 71.45 ±13.29＊＊ 50.65 ±7.65＊＊

3.3 Western blot法檢測SMMC-7721細胞中Bax、Bcl-2、Caspase9蛋白的表達 秦皮乙素 (1.12、2.24、4.48、8.96 mmol/L)作用人肝癌SMMC-7721細胞24 h后，Bcl-2蛋白表達降低，Bax蛋白表達增加，Caspase-9蛋白表達也隨著秦皮乙素濃度的增加而增強。見圖2。

圖2 秦皮乙素對人肝癌細胞 SMMC-7721 Bax、Bcl-2、Caspase-9蛋白表達的影響Fig.2 Effects of aesculetin on expressions of protein Bax，Bcl-2 and Caspase-9 in human hepatoma SMMC-7721

3.4 免疫熒光法檢測 Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表達 秦皮乙素 (1.12、2.24、4.48 mmol/L)作用人肝癌SMMC-7721細胞24 h后，Bax蛋白的表達增加，Bcl-2蛋白的表達降低，因此Bax/Bcl-2比例顯著升高，進而活化Caspase-9、Caspase-3，使 Caspase-9、Caspase-3活性增加。見表3。

表3 秦皮乙素對人肝癌細胞SMMC-7721凋亡調控蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9表達的影響 (n=5，±s)Tab.3 Effects of aesculetin on expressions of apoptosis protein Bax，Bcl-2，Caspase-3 and Caspase-9 in human hepatoma SMMC-7721(n=5，±s)

表3 秦皮乙素對人肝癌細胞SMMC-7721凋亡調控蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9表達的影響 (n=5，±s)Tab.3 Effects of aesculetin on expressions of apoptosis protein Bax，Bcl-2，Caspase-3 and Caspase-9 in human hepatoma SMMC-7721(n=5，±s)

注:與對照組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

.08 76.01 ±2.675-Fu 0.77 mmol/L組 103.9±2.43* 94.86±2.36 1.095±0.03＊＊ 110.68±7.64 92.04±5.74*秦皮乙素1.12 mmol/L組 126.8±5.67＊＊ 170.25±7.97＊＊ 0.745±0.027＊＊ 131.39±7.61＊＊ 115.36±10.57＊＊秦皮乙素2.24 mmol/L組 144.7±3.11＊＊ 124.77±3.01＊＊ 1.16±0.038＊＊ 179.01±7.92＊＊ 146.45±10.68＊＊秦皮乙素4.48 mmol/L組 172.6±4.99＊＊ 106.51±2.33＊＊ 1.621±0.057＊＊ 200.31±4.94＊＊ 175.13±4.80陰性對照組 92.77±9.86 175.56±0.599 0.529±0.05 91.81±7＊＊Bax Bcl-2 Bax/Bcl-2 Caspase3 Caspase9組 別

4 討論

原發性肝癌是常見的惡性腫瘤之一，據世界衛生組織統計，最近10年全球肝癌發病率及死亡率增長了約22%。細胞凋亡與腫瘤的關系備受重視。正常細胞通過增生和凋亡來維持自身穩定，若兩者失衡，則可導致腫瘤發生。

Chu、Wang等［3-4］初步探討了秦皮乙素對人類白血病細胞和胸部腫瘤的抗腫瘤機理。主要機理為促進細胞色素C從線粒體中釋放，活化Caspase-9誘導凋亡，并且具有濃度和時間的依賴性。此外秦皮乙素是 Caspase-3的底物，它可通過激活Caspase-3，促使細胞凋亡。秦皮乙素作用9 h后，可將Bcl-2蛋白的表達減少至58%，秦皮乙素作用24 h后可剪切腺苷二磷酸核糖聚合酶 (ADP-ribose)。在前期的研究中，通過MTT法及流式細胞儀檢測細胞周期和細胞凋亡，已經初步證明秦皮乙素可抑制肝癌細胞的生長并誘導其凋亡［7］。

細胞凋亡是一種程序性細胞死亡過程。目前已知兩種信號途徑可以誘導細胞凋亡發生，即由死亡受體介導的外源性途徑和由線粒體介導的內源性途徑。兩種途徑通過分別特異性活化Caspase-8和Caspase-9，最后都作用于Caspase-3，誘導細胞凋亡。在內源性途徑中，線粒體膜電位降低是細胞凋亡過程中的首要事件。在線粒體內、外膜交界處存在膜滲透性轉換通道，該通道的開放會引起線粒體膜電位的下降，呼吸鏈斷裂，誘導細胞凋亡［8］。本試驗采用熒光探針JC-1檢測線粒體膜電位的變化，結果顯示，秦皮乙素作用24 h后，呈濃度依賴性地使人肝癌細胞SMMC-7721線粒體膜電位下降。表明線粒體參與了秦皮乙素誘導人肝癌細胞SMMC-7721凋亡發生。

Bcl-2家族蛋白是細胞通過內源性途徑促進凋亡的重要調節因子，決定細胞能否通過改變線粒體膜電位激活Caspase家族，最終發生凋亡。為此本試驗通過蛋白印跡法和免疫熒光法研究秦皮乙素對Bax，Bcl-2蛋白表達的影響。結果表明，秦皮乙素在抑制Bcl-2蛋白表達的同時使Bax蛋白的表達增加。進一步的研究發現，秦皮乙素可通過活化Caspase-3，Caspase-9而激活Caspase級聯反應。

可見，秦皮乙素能夠降低人肝癌細胞SMMC-7721線粒體膜電位，同時抑制Bcl-2蛋白表達，升高Bax/Bcl-2比例。活化Caspase-3，Caspase-9。通過內源性途徑誘導人肝癌細胞SMMC-7721凋亡。

本實驗對于秦皮乙素抗腫瘤機制的研究還不夠深入，只是探討了其對腫瘤細胞凋亡方面的影響，秦皮乙素能否增強機體免疫;對腫瘤相關的癌基因與抑癌基因的表達是否有影響;對腫瘤細胞的黏附、生長、轉移是否有抑制作用等，都需要更深入的探討。

［1］汪國松，楊亞濱，李璠等.秦皮的研究進展［J］.國外醫藥:植物藥分冊，2007，22(3):108-111.

［2］方蓮花，呂 揚，杜冠華.秦皮的藥理作用研究進展［J］.中國中藥雜志，2008，33(23):2732-2736.

［3］Chu C Y，Tsai Y Y，Wang C J，et al.Induction of apoptosis by esculetin in human leukemia cells［J］.Eur J Pharmacol，2001:416(1-2):25-32.

［4］Wang C J，Hsieh Y J，Chu C Y，et al.Inhibition of cell cycle progression in human leukemia HL-60 cells by esculetin［J］.Cancer Lett，2002，183(2):163-168.

［5］司徒鎮強，吳軍正.細胞培養［M］.西安:世界圖書出版西安公司，2004:195-367.

［6］曲 佳，郭坤元，吳秉毅等.冬凌草甲素誘導人多發性骨髓瘤ARH-77凋亡及其可能機制［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2010，17(2):134-138.

［7］王 晶，王洪新，李紅玉.秦皮乙素的制備及對人肝癌細胞SMMC-7721體外增殖的影響［J］.中國現代應用藥學，2009，26(6):439-442.

［8］宋少華，郭聞淵，傅志仁，等.丹參多酚酸鹽通過線粒體途徑誘導人肝癌SMMC-7721細胞的凋亡［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2010，17(1):62-66.

［9］林 箐，彭華毅.黃葵素誘導小鼠黑色素瘤B-16細胞凋亡的研究［J］.中國藥理學通報，2010，26(12):1630-1634.

［10］Noguchi M，Earashi M，Minami M，et al.Effects of piroxicam and esculetin on the MDA-MB-231 human breast cancer cell line［J］.Prosaglandins Lenkot Essent Fatty Acids，1995，53(5):325-329.

［11］Harada K，Bando T，Yoshida H，et al.Characteristics of antitumour activity of cepharanthin against a human adenosquamous cellcarcinoma cell line［J］.Oral Oncol，2001，37(8):643-651.

［12］江國松，楊亞萍.秦皮研究進展［J］.國外醫藥:植物藥分冊，2007，22(3):108-111.