大鼠血漿中綠原酸和木犀草苷的HPLC法測(cè)定

沈 熊， 梁 健， 楊春欣， 呂遷洲

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院藥劑科，上海200032)

咽炎合劑為本院自制制劑，臨床應(yīng)用已十余年，療效確切，副作用小。本品由金銀花、射干、山豆根、甘草、陳皮五味中藥組成，具有清熱解毒、消炎止痛，用于急、慢性咽炎及扁桃體炎等。金銀花是咽炎合劑的主藥，為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花［1］。金銀花中含有機(jī)酸、黃酮類、揮發(fā)油、三萜類、苷類、微量元素等成分，其中活性成分是綠原酸(Chlorogenic acid)為代表的有機(jī)酸類以及木犀草苷 (Luteoloside)為代表的黃酮類成分［2-3］。二者的研發(fā)報(bào)道較多［4-6］，而同時(shí)測(cè)定其在血漿中質(zhì)量濃度則尚未見報(bào)道。LC-MS法用于分析生物樣品，在靈敏度和特異性方面有很大優(yōu)勢(shì)，但該儀器昂貴，本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法，并優(yōu)化色譜和血漿處理?xiàng)l件，以槲皮素 (Quercetin)為內(nèi)標(biāo)，測(cè)定大鼠灌胃后體內(nèi)綠原酸和木犀草苷的質(zhì)量濃度，并計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，為咽炎合劑的進(jìn)一步研發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相系統(tǒng) (G1312A二元泵、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1314D可見紫外光檢測(cè)器等)，Agilent ChemStation B.04.02工作站。

綠原酸對(duì)照品 (10713-205213)，木犀草苷對(duì)照品 (1112061200302)和內(nèi)標(biāo)槲皮素對(duì)照品(1113202101216)由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。樣品咽炎合劑 (批號(hào)20110403)，本院自制。

SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量155～175 g，由上海西普爾-必凱動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證:SCXK(滬)2008-0016，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)1周。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制 對(duì)照品貯備液:精密稱取綠原酸對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制得質(zhì)量濃度為850 g/L的綠原酸對(duì)照品貯備液，同法制得質(zhì)量濃度為1010 g/L的木犀草苷對(duì)照品貯備液。避光，4℃冰箱中保存，使用前用甲醇稀釋至所需濃度。

內(nèi)標(biāo)溶液:精密稱取槲皮素對(duì)照品適量，參照上述方法制得質(zhì)量濃度為360 g/L的槲皮素內(nèi)標(biāo)貯備液。

2.2 色譜條件 Phenomenex Luna C18柱 (150 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流動(dòng)相為0.4%醋酸溶液(A)-甲醇 (B)，B泵的比例0～40 min從10%上升到80%，體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm;柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL。

2.3 血漿樣品預(yù)處理 精密吸取血漿樣品200 μL，置10 mL具塞試管中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，漩渦30 s，加入叔丁基甲醚2 mL，漩渦混合2 min，5000 r/min離心5 min，取上清液，50℃水浴中氮?dú)獯蹈桑约状?－0.4%醋酸溶液(50∶50)200 μL溶解殘?jiān)?000 r/min離心 5 min，取 100 μL 進(jìn)樣。

2.4 專屬性試驗(yàn) 分別取混合對(duì)照品溶液、大鼠空白血漿、空白血漿加入綠原酸、木犀草苷和槲皮素，以及大鼠給藥后30 min后的血樣，進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見圖1。結(jié)果表明，綠原酸、木犀草苷和槲皮素與其它組分分離良好，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)和代謝產(chǎn)物不干擾測(cè)定，結(jié)果見圖1。

圖1 綠原酸、木犀草苷和檞皮素的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of chlorogenic acid in rat plasma

2.5 線性范圍 取大鼠空白血漿200 μL，加入10、40、80、120、160、200 g/L系列質(zhì)量濃度對(duì)照品綠原酸溶液10 μL，混勻;再分別加入2、10、20、30、40和50 g/L系列質(zhì)量濃度對(duì)照品木犀草苷溶液10 μL，混勻，則血漿中綠原酸質(zhì)量濃度分別為0.5、2、4、6、8和10 g/L，木犀草苷質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1、1.5、2和2.5 g/L，按2.3項(xiàng)下方法處理，進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。分別以綠原酸、槲皮素峰面積之比 (R1)以及木犀草苷、槲皮素峰面積之比 (R2)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為R1=3.61C+0.128，r=0.999;R2=5.06C+0.296，r=0.999，表明血漿中綠原酸和木犀草苷分別在0.5～10 g/L和0.1～2.5 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，綠原酸和木犀草苷的定量限分別為為0.5 g/L和0.1 g/L。

2.6 回收率試驗(yàn) 同上配制含綠原酸和木犀草苷高、中、低質(zhì)量濃度的血樣，各5份，按2.3項(xiàng)下方法處理，進(jìn)行測(cè)定，記錄綠原酸、木犀草苷和槲皮素的峰面積，將綠原酸、槲皮素以及木犀草苷、槲皮素比值分別代入各自回歸方程，計(jì)算相對(duì)回收率，結(jié)果見表1。

2.7 精密度試驗(yàn) 同上配制含綠原酸和木犀草苷高、中、低質(zhì)量濃度的血樣，各5份，按2.3項(xiàng)下方法處理，于1 d內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，記錄綠原酸、木犀草苷和槲皮素的峰面積，將綠原酸、槲皮素以及木犀草苷、槲皮素比值分別代入各自回歸方程，計(jì)算日內(nèi)變異。上述各濃度樣品連續(xù)測(cè)定5 d，同上計(jì)算日間變異。結(jié)果見表2。

表1 綠原酸和木犀草苷相對(duì)回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Recovery rate of chlorogenic acid and luteoloside

表2 綠原酸和木犀草苷精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Intra-day and inter-day precision of chlorogenic acid and luteoloside

2.8 藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn) 大鼠6只，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，按10 mL/kg劑量灌胃給藥，給藥后 5、15、30、60、120、240、360、480 min于眼底靜脈叢采血，置1.5 mL肝素抗凝離心管，4000 r/min離心10 min，分離出血漿，－80℃冷凍保存待測(cè)。

按2.3項(xiàng)下方法處理血漿，測(cè)定綠原酸和木犀草苷在大鼠體內(nèi)的平均血藥濃度，藥—時(shí)曲線見圖2，用WinNonlin(Ver 4.1，Pharsight，USA)軟件處理，綠原酸和木犀草苷呈非房室模型，采用非房室模型 (統(tǒng)計(jì)矩)計(jì)算結(jié)果，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表3。

圖2 綠原酸和木犀草苷的藥—時(shí)曲線Fig.2 Mean drug plasma concentration-time profiles of chlorogenic acid and luteoloside

表3 主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab.3 Main pharmacokinetic data

3 討論

綠原酸為金銀花活性成分，常用作藥材和制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)。木犀草苷是金銀花區(qū)別山銀花的特征成分，具有較強(qiáng)的抗呼吸道合胞體病毒活性，是其抗菌抗病毒的有效成分之一。因此，在金銀花藥材提取工藝、制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、以及藥效監(jiān)測(cè)研究中，不能僅以單一成分為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，應(yīng)結(jié)合藥理研究，選擇合理的指標(biāo)，以保證方法的可行性和藥效。

在色譜條件的選擇上，參考綠原酸和木犀草苷的最大吸收波長(zhǎng)分別為330 nm［7-8］和350 nm文獻(xiàn)［4，6］，也有文獻(xiàn)采用 350 nm 檢測(cè)綠原酸等成分［9］，實(shí)驗(yàn)中比較兩種波長(zhǎng)測(cè)定綠原酸，發(fā)現(xiàn)積峰面積相差不超過5%，采用350 nm測(cè)定綠原酸，可以達(dá)到本次實(shí)驗(yàn)的要求，因此設(shè)置統(tǒng)一波長(zhǎng)測(cè)定綠原酸和木犀草苷，使實(shí)驗(yàn)更加簡(jiǎn)便易行。合劑作為中藥制劑的典型，其成分十分復(fù)雜，給測(cè)定帶來一定困難，在測(cè)定前，必須對(duì)樣品進(jìn)行分離純化處理［10］。經(jīng)參考文獻(xiàn)［11-12］及根據(jù)實(shí)際操作結(jié)果不斷改進(jìn)，最終確定了HPLC法測(cè)定綠原酸和木犀草苷的含量的方法。

從藥—時(shí)曲線和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)上看，綠原酸和木犀草苷在體內(nèi)的濃度差別很大，但變化趨勢(shì)相似，吸收快速，兩者均呈現(xiàn)非房室模型。

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