大鼠血漿中綠原酸和木犀草苷的HPLC法測定

沈 熊， 梁 健， 楊春欣， 呂遷洲

(復旦大學附屬中山醫院藥劑科，上海200032)

咽炎合劑為本院自制制劑，臨床應用已十余年，療效確切，副作用小。本品由金銀花、射干、山豆根、甘草、陳皮五味中藥組成，具有清熱解毒、消炎止痛，用于急、慢性咽炎及扁桃體炎等。金銀花是咽炎合劑的主藥，為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花［1］。金銀花中含有機酸、黃酮類、揮發油、三萜類、苷類、微量元素等成分，其中活性成分是綠原酸(Chlorogenic acid)為代表的有機酸類以及木犀草苷 (Luteoloside)為代表的黃酮類成分［2-3］。二者的研發報道較多［4-6］，而同時測定其在血漿中質量濃度則尚未見報道。LC-MS法用于分析生物樣品，在靈敏度和特異性方面有很大優勢，但該儀器昂貴，本實驗建立了HPLC法，并優化色譜和血漿處理條件，以槲皮素 (Quercetin)為內標，測定大鼠灌胃后體內綠原酸和木犀草苷的質量濃度，并計算藥動學參數，為咽炎合劑的進一步研發提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相系統 (G1312A二元泵、G1329A自動進樣器、G1314D可見紫外光檢測器等)，Agilent ChemStation B.04.02工作站。

綠原酸對照品 (10713-205213)，木犀草苷對照品 (1112061200302)和內標槲皮素對照品(1113202101216)由中國食品藥品檢定研究院提供，甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，試驗用水為二次蒸餾水。樣品咽炎合劑 (批號20110403)，本院自制。

SPF級SD大鼠，體質量155～175 g，由上海西普爾-必凱動物有限公司提供，動物許可證:SCXK(滬)2008-0016，實驗前適應1周。

2 方法與結果

2.1 溶液配制 對照品貯備液:精密稱取綠原酸對照品適量，加甲醇溶解，制得質量濃度為850 g/L的綠原酸對照品貯備液，同法制得質量濃度為1010 g/L的木犀草苷對照品貯備液。避光，4℃冰箱中保存，使用前用甲醇稀釋至所需濃度。

內標溶液:精密稱取槲皮素對照品適量，參照上述方法制得質量濃度為360 g/L的槲皮素內標貯備液。

2.2 色譜條件 Phenomenex Luna C18柱 (150 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流動相為0.4%醋酸溶液(A)-甲醇 (B)，B泵的比例0～40 min從10%上升到80%，體積流量1.0 mL/min;檢測波長350 nm;柱溫30℃，進樣量20 μL。

2.3 血漿樣品預處理 精密吸取血漿樣品200 μL，置10 mL具塞試管中，精密加入內標溶液10 μL，漩渦30 s，加入叔丁基甲醚2 mL，漩渦混合2 min，5000 r/min離心5 min，取上清液，50℃水浴中氮氣吹干，以甲醇 －0.4%醋酸溶液(50∶50)200 μL溶解殘渣，5000 r/min離心 5 min，取 100 μL 進樣。

2.4 專屬性試驗 分別取混合對照品溶液、大鼠空白血漿、空白血漿加入綠原酸、木犀草苷和槲皮素，以及大鼠給藥后30 min后的血樣，進行測定，色譜圖見圖1。結果表明，綠原酸、木犀草苷和槲皮素與其它組分分離良好，血漿中內源性物質和代謝產物不干擾測定，結果見圖1。

圖1 綠原酸、木犀草苷和檞皮素的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of chlorogenic acid in rat plasma

2.5 線性范圍 取大鼠空白血漿200 μL，加入10、40、80、120、160、200 g/L系列質量濃度對照品綠原酸溶液10 μL，混勻;再分別加入2、10、20、30、40和50 g/L系列質量濃度對照品木犀草苷溶液10 μL，混勻，則血漿中綠原酸質量濃度分別為0.5、2、4、6、8和10 g/L，木犀草苷質量濃度分別為0.1、0.5、1、1.5、2和2.5 g/L，按2.3項下方法處理，進行測定，記錄色譜圖。分別以綠原酸、槲皮素峰面積之比 (R1)以及木犀草苷、槲皮素峰面積之比 (R2)為縱坐標，質量濃度C為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為R1=3.61C+0.128，r=0.999;R2=5.06C+0.296，r=0.999，表明血漿中綠原酸和木犀草苷分別在0.5～10 g/L和0.1～2.5 g/L范圍內線性關系良好，綠原酸和木犀草苷的定量限分別為為0.5 g/L和0.1 g/L。

2.6 回收率試驗 同上配制含綠原酸和木犀草苷高、中、低質量濃度的血樣，各5份，按2.3項下方法處理，進行測定，記錄綠原酸、木犀草苷和槲皮素的峰面積，將綠原酸、槲皮素以及木犀草苷、槲皮素比值分別代入各自回歸方程，計算相對回收率，結果見表1。

2.7 精密度試驗 同上配制含綠原酸和木犀草苷高、中、低質量濃度的血樣，各5份，按2.3項下方法處理，于1 d內進行測定，記錄綠原酸、木犀草苷和槲皮素的峰面積，將綠原酸、槲皮素以及木犀草苷、槲皮素比值分別代入各自回歸方程，計算日內變異。上述各濃度樣品連續測定5 d，同上計算日間變異。結果見表2。

表1 綠原酸和木犀草苷相對回收率試驗結果Tab.1 Recovery rate of chlorogenic acid and luteoloside

表2 綠原酸和木犀草苷精密度試驗結果Tab.2 Intra-day and inter-day precision of chlorogenic acid and luteoloside

2.8 藥動學試驗 大鼠6只，雌雄各半，實驗前禁食12 h，自由飲水，按10 mL/kg劑量灌胃給藥，給藥后 5、15、30、60、120、240、360、480 min于眼底靜脈叢采血，置1.5 mL肝素抗凝離心管，4000 r/min離心10 min，分離出血漿，－80℃冷凍保存待測。

按2.3項下方法處理血漿，測定綠原酸和木犀草苷在大鼠體內的平均血藥濃度，藥—時曲線見圖2，用WinNonlin(Ver 4.1，Pharsight，USA)軟件處理，綠原酸和木犀草苷呈非房室模型，采用非房室模型 (統計矩)計算結果，主要藥動學參數見表3。

圖2 綠原酸和木犀草苷的藥—時曲線Fig.2 Mean drug plasma concentration-time profiles of chlorogenic acid and luteoloside

表3 主要藥動學參數Tab.3 Main pharmacokinetic data

3 討論

綠原酸為金銀花活性成分，常用作藥材和制劑的質量控制指標。木犀草苷是金銀花區別山銀花的特征成分，具有較強的抗呼吸道合胞體病毒活性，是其抗菌抗病毒的有效成分之一。因此，在金銀花藥材提取工藝、制劑質量標準、以及藥效監測研究中，不能僅以單一成分為指標進行評價，應結合藥理研究，選擇合理的指標，以保證方法的可行性和藥效。

在色譜條件的選擇上，參考綠原酸和木犀草苷的最大吸收波長分別為330 nm［7-8］和350 nm文獻［4，6］，也有文獻采用 350 nm 檢測綠原酸等成分［9］，實驗中比較兩種波長測定綠原酸，發現積峰面積相差不超過5%，采用350 nm測定綠原酸，可以達到本次實驗的要求，因此設置統一波長測定綠原酸和木犀草苷，使實驗更加簡便易行。合劑作為中藥制劑的典型，其成分十分復雜，給測定帶來一定困難，在測定前，必須對樣品進行分離純化處理［10］。經參考文獻［11-12］及根據實際操作結果不斷改進，最終確定了HPLC法測定綠原酸和木犀草苷的含量的方法。

從藥—時曲線和藥動學參數上看，綠原酸和木犀草苷在體內的濃度差別很大，但變化趨勢相似，吸收快速，兩者均呈現非房室模型。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版二部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:205.

［2］黃喜茹，劉偉娜，曹 冬.金銀花的化學成分藥理作用研究評價［J］.中醫藥學刊，2005，23(3):418-419.

［3］宋 健，張會敏，郭承軍，等.金銀花抗流感病毒活性成分峰的化合物歸屬研究［J］.中成藥，2011，33(6):1017-1021.

［4］閔春艷，游本剛，許瓊明，等.正交試驗比較金銀花藥材中綠原酸與木犀草苷的乙醇提取工藝［J］.中成藥，2011，33(10):1815-1818.

［5］趙琰玲，尹 蓮.金銀花化學成分與有效成分提取研究進展［J］.醫藥導報，2007，26(5):521-522.

［6］郭 玉，鄭 興，曹 軒，等.RP-HPLC測定金銀花葉中木犀草苷的含量［J］.中成藥，2009，31(8):1299-1300.

［7］孫艷濤，王 冰，李 莉.梯度洗脫法同時測定不同配比金銀花連翹藥對中綠原酸、連翹脂素［J］.中成藥，2011，33(5):821-823.

［8］梁少強，謝仕偉，李國榮，等.治感靈顆粒質量標準的研究［J］.中成藥，2010，32(6):1078-1080.

［9］施 法，侯 峰.金銀花中3種成分含量的超高速液相色譜法同時測定［J］.時珍國醫國藥，2010，21(11):3014-3015.

［10］劉德軍.對《中國藥典》2010版一部同名不同劑型中藥制劑質量控制的探討［J］.中成藥，2010，32(12):2151-2153.

［11］陳澤賓，姚 芳，雷雪兒，等.液相串聯質譜聯用法研究金銀花黃酮提取物在大鼠體內的藥動學［J］.中國醫院藥學雜志，2010，30(09):743-746.

［12］于天杰，張玲昂.咽炎合劑的質量控制［J］.中國實用醫藥，2009，4(26):151-152.