HPLC-ICP-MS法研究5種含雄黃中成藥的可溶性砷及其形態

李麗敏， 夏 晶， 王欣美， 王枚博， 王 柯， 季 申

(上海市食品藥品檢驗所，上海201203)

礦物藥雄黃主要成分是四硫化四砷 (As4S4)和硫化砷 (AsS)，此外雄黃中還含有少量的As2O3或As2O［1］5。砷為劇毒元素，國際上對其有嚴格的限量標準［2-3］，故雄黃安全性受到質疑。然而許多含雄黃傳統中藥對一些疑難雜癥有特殊療效，近年國內醫學研究發現含雄黃的復方制劑或單方對于治療血液系統疾病、惡性淋巴系統疾病甚至實體瘤有著顯著效果［4-6］，雄黃中砷雖然有毒性但也可能是治療的有效成分。許多研究者對含雄黃中藥用量與毒性展開討論［7-8］，其焦點是該類制劑中雄黃所含砷引發的毒性問題;研究結果表明，含雄黃中藥制劑經口服后，其所含的砷并非全部被人體吸收［9］，說明雄黃中所含有的大量不被機體所吸收的砷是無效或無毒成分。

砷元素作用于人體，其活性和毒性與其存在形態密切相關。雄黃中主成分砷進入機體后會發生生物轉化，經酶催化通過氧化還原、生物甲基化、生物合成等過程會產生多種砷的形態，其在體內的存在形態主要包括四類:無機砷 (亞砷酸鹽和砷酸鹽)、有機砷小分子 (甲基砷酸、二甲基砷酸)、砷的有機化合物(砷甜菜堿、砷膽堿、乳酸三甲基砷、砷酯及砷糖等)、含砷的生物大分子 (不同價態的砷化物與轉鐵白蛋白或血紅蛋白的結合物)［10］。其中亞砷酸 (As3+)比砷酸 (As5+)更容易與蛋白質中的巰基結合，所以毒性最大，一甲基砷酸 (MMA)和二甲基砷酸 (DMA)只具有中等毒性，而動植物中的砷甜菜堿和砷膽堿幾乎無毒性［11］。以總砷為標準，該類中藥砷含有量將大大高于限量，是不客觀和不合理的。

國內學者對于含雄黃中藥可溶性砷總量或其形態研究逐漸增多［12-14］，多采用模擬體內仿生提取法研究人工胃液或人工腸液中可溶性砷及其形態;但對采用其他提取溶劑進行含雄黃中藥可溶性砷的研究尚未見報道。含雄黃中藥成分復雜，同一處方中其他中藥材不僅會影響雄黃中砷在體內的溶出，而且可能會對其中砷的價態產生影響，也可能會形成砷絡合物;本實驗旨在通過不同提取溶劑和提取方法的研究，采用高效液相色譜 (HPLC)-電感耦合等離子體質譜 (ICP-MS)聯用技術同時、快速分析6種砷形態，研究探討不同提取溶劑中藥雄黃及5種不同含雄黃復方制劑中可溶性砷含有量及其形態分布，為含雄黃中藥的標準及其限量制訂研究奠定了基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器 美國Agilent 1100高效液相色譜儀(HPLC);美國Agilent 7500Ce電感耦合等離子體質譜儀 (ICP-MS);美國 Millipore超純水機(Milli-Q);Dionex公司的ASE100型快速溶劑萃取儀;美國CEM微波消解儀。

1.2 試劑及試藥

1.2.1 試劑 磷酸二氫銨、EDTA均為分析純;超純水:電阻率18.2 MΩ/cm;鹽酸、硝酸、甲醇均購于德國 Merck 公司;7Li、89Y、140Ce、205Tl調諧液購于美國Agilent公司。

1.2.2 標準溶液 砷標準溶液 (1.00 g/L)、亞砷酸根溶液標準物質 ［(As(Ⅲ)，μmol/g)］、砷酸根溶液標準物質［(As(Ⅴ)，0.233 μmol/g)］、一甲基砷溶液標準物質 (MMA，二甲基砷溶液標準物質 (DMA，CH3CH2AsO2=0.706 μmol/g)、砷膽堿溶液標準物質 (AsC，C5H14AsBrO=0.374 μmol/g)、砷甜菜堿溶液標準物質 (AsB，C5H11AsO2=0.518 μmol/g)購于國家標準物質中心。

1.2.3 標準物質 茶葉 (地礦部物化探研究所，GBW10016(GSB-7);金槍魚 (TUNA FISH TISSUE，BCR-627，Institute for Reference Materials and Measurements)，海 藻 (Seaweed，T07129， The Food and Encironment Research Agency)。

1.2.4 試藥 雄黃藥材 (Y1);雄黃炮制品 (水飛)(Y2);七味新消丸 (Y3)、萬靈片 (Y4)、牛黃醒消丸 (Y5)、牛黃抱龍片 (Y6)和牛黃消炎片 (Y7)由上海雷允上藥業有限公司提供。除雄黃和水飛雄黃外，將其余樣品均研細后過九號篩。

2 方法與結果

2.1 ICP-MS及HPLC-ICP-MS測定條件 以10 μg/L 的7Li、89Y、140Ce、205Tl調諧液對 ICP-MS 進行調諧，使89Y靈敏度達到最優，同時使75As有較高靈敏度和較低檢測限;ICP-MS儀器參數:射頻功率1450 W，射頻電壓1.79 V，載氣體積流量1.10 L/min，蠕動泵流速0.1 r/s，氦反應碰撞模式，測定砷總量選擇全定量模式;HPLC-ICP-MS工作條件:采用Hamilton PRP-X100(250 mm×4.1 mm，10 μm)陰離子交換色譜柱，以 50 mmol/L NH4H2PO4(pH 8.0)為流動相，ICP-MS選擇時間分辨模式，其他條件同ICP-MS儀器參數。

2.2 標準品溶液的制備及線性關系考察

2.2.1 砷標準溶液的制備及線性關系考察 精密吸取砷標準溶液適量，用稀釋液 (含1%鹽酸、2%硝酸和1%甲醇的混合溶液)制成每1 L含砷0、1、5、20、50、100、250 μg的系列溶液，作為測定砷總量和可溶性砷總量的標準曲線。在0～250 μg/L質量濃度范圍內，砷元素線性方程為:A=4.010×10－3C+1.021 ×10－4(相關系數 R=0.9996)，線性關系良好。

2.2.2 砷價態標準溶液的制備及線性關系考察精密吸取As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA、AsC和AsB標準物質溶液適量，用0.05 mol/L EDTA溶液制成每 1 L含 As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA、MMA、AsC和 AsB等不同價態砷 0、5、10、20、50、100、200 μg的系列混合標準溶液。以質量濃度為橫坐標，以各待測峰峰面積為縱坐標繪制標準曲線。6種價態的砷在擬訂色譜條件下分離較好 (見圖1)，在0～200 μg/L質量濃度范圍內線性關系良好 (見表1)。

圖1 砷的6種形態分析色譜圖Fig.1 Chromatogram for six speciations of arsenic

表1 6種不同價態砷的標準曲線方程Tab.1 Equation of the six different arsenic speciations

2.3 總砷含有量測定 精密稱取雄黃及水飛雄黃0.05 g、含雄黃中藥0.3～0.5 g于微波消解罐中，加入5 mL消解液 (硝酸∶鹽酸3∶1)，放置30 min后，將密封罐置于微波消解儀中按既定程序進行消解，若消解不完全則再加入1 mL消解液，繼續消解至罐內溶液澄清為止。將消解后樣品轉移至50 mL聚四氟乙烯量瓶中，定容至刻度，樣品溶液以稀釋液進行適當稀釋，采用ICP-MS測定砷總量。

2.3.1 準確度與精密度 取茶葉標準物質0.5 g，按照供試品溶液制備方法制備，以既定方法用ICP-MS測定砷總量，一式6份平均測定結果為0.082 mg/kg，RSD為7.8%;測定結果在標準物質標準范圍內 (0.09±0.01)mg/kg，說明測定方法準確度高，精密度好。

2.3.2 樣品中總砷含有量 7種雄黃及其復方制劑中總砷的定量分析結果見表2。由表2可見，若以總砷計則均遠遠超出《中國藥典》2010年版一部中規定的中藥材允許限量值2 mg/kg。

表2 總砷測定結果Tab.2 Result of total arsenic in samples

2.4 可溶性砷提取方法 精密稱取雄黃及水飛雄黃0.1 g、含雄黃中藥0.5 g，分別用以下方法進行提取。

2.4.1 快速溶劑萃取 (ASE) 精密稱取樣品于不銹鋼萃取池中。萃取程序如下:萃取時間為平衡5 min，重復2次;萃取溫度為100℃;萃取溶劑為甲醇/水 (V/V，1∶1);萃取壓力為1500 psi(1 psi=6.895 kPa)。萃取液在40℃水浴中旋轉蒸發近干，殘渣用超純水溶解，恒定質量至10 g，即得。

2.4.2 甲醇超聲提取 精密稱取樣品于50 mL具塞離心管中，加入10 mL甲醇－水 (V/V，1∶1)冰浴超聲60 min，然后置于離心機中以5000 r/min旋轉30 min，精密吸取上清液5 mL，在40℃水浴中旋轉蒸發近干，殘渣用超純水溶解，定質量至10 g，即得。

2.4.3 0.16%鹽酸超聲提取 精密稱取樣品于50 mL具塞離心管中，精密加入10 mL 1%鹽酸(V/V)溶液，混勻，冰浴超聲60 min，然后置于離心機中以5000 r/min旋轉30 min，取上清液即得。

2.4.4 模擬人工胃液振蕩提取 精密稱取樣品于50 mL具塞離心管中，精密加入10 mL人工胃液，混勻，置于搖床上，控制溫度37℃，振搖4 h。冷卻，然后置于離心機中以5000 r/min旋轉30 min，取上清液即得。

以上樣品溶液均過0.22 μm的濾膜，取續濾液按砷形態分析方法測定不同提取條件下可溶性砷形態;樣品溶液經稀釋液稀釋后，按照砷總量測定條件測定不同提取條件下可溶性砷總量。

2.5 可溶性砷準確度及精密度 取標準物質金槍魚0.5 g含砷甜菜堿 (3.9±0.225)mg/kg，二甲基砷 (0.15±0.0225)mg/kg，及海藻0.1 g含無機砷 ［As(Ⅲ)和As(Ⅴ)］86～118 mg/kg。按照可溶性砷的提取方法提取，分別測定標準物質中有機砷和無機砷的價態，各一式6份，用以可溶性砷準確度和精密度試驗。結果見表3，表4。

結果表明，不同提取方法的有機砷 (金槍魚)和無機砷 (海藻)提取結果均在標準值范圍內; 方法重復性RSD均小于10%。

表3 標準物質金槍魚中有機砷價態的準確度及精密度試驗Tab.3 Accuracy and reproducibility of the organic arsenic in standard substance(tuna fish)

表4 標準物質海藻中不同價態砷準確度及精密度試驗Tab.4 Accuracy and reproducibility of the inorganic arsenic in standard substance(Seawead)

2.6 可溶性砷總量及形態的測定

2.6.1 可溶性砷總量 將2.4.1項～2.4.4項的樣品溶液經一定比例稀釋后，按照砷總量測定條件采用ICP-MS測可溶性砷總量，結果見表5。將不同提取方法的可溶性砷總量與各樣品中所含總砷量進行比較 (見表6)，結果表明可溶性砷的量僅占總砷量的0.10%～2.70%。

表5 可溶性砷總量結果Tab.5 Results of total soluble arsenic

表6 可溶性砷總量與總砷含有量百分比Tab.6 Total soluble arsenic in the percentage of the total arsenic

2.6.2 可溶性砷的形態分析 將2.4.1項～2.4.4項的樣品溶液按照既定條件進行測定，考察不同提取溶劑提取出可溶性砷的形態 (見圖1～2)。將測得的形態含量總和與各樣品總砷量及可溶性砷總量進行比較，結果發現:不同方法提取出的砷價態均僅有三價砷 ［As(Ⅲ)］和五價砷 ［As(Ⅴ)］兩種價態，結果見表7～8。

圖2 樣品中可溶性砷形態分析色譜圖Fig.2 Chromatogram for the speciation of the soluble arsenic in the sample

2.7 不同砷價態的檢測限 以5 μg/L的不同價態砷標準混合溶液進樣分析，計算各峰信噪比，并換算至3倍信噪比，作為不同砷價態的檢測限，As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA、MMA、AsC、AsB的檢測限分別為 2.4、2.6、2.5、2.7、1.8、0.9 μg/L。

3 討論

3.1 可溶性砷不同提取溶劑和方法比較研究 砷形態分析中常用酸性溶劑提取毒性較大的無機砷，另外甲醇-水 (1∶1)也是常用的砷形態提取溶劑，該溶劑可提取砷的無機和有機形態［15］。含雄黃中藥口服后經胃液消化再進入體內，因此許多學者應用仿生手段模擬人工胃液提取可溶性砷，本課題除研究模擬人體條件下提取的可溶性砷外，還結合0.16%鹽酸溶液，甲醇-水 (1∶1)等不同提取溶劑采用水浴振蕩、超聲等不同提取方法，對含雄黃中藥中可溶性砷形態進行全面研究，采用無機砷和有機砷標準物質進行方法學研究表明，方法準確度和精密度良好。

表7 可溶性砷的形態測定結果Tab.7 Results of the speciation of the soluble arsenic

表8 可溶性砷形態與總砷量、可溶性砷總量比較Tab.8 Comparison of total arsenic and total soluble arsenic with the speciation of the soluble arsenic

由表5結果可知采用人工胃液振蕩提取、0.16%鹽酸溶液超聲提取，其提出的可溶性砷量基本相當，因此在模擬人體研究中采用超聲方法代替振蕩，顯著提高效率。選用甲醇-水 (1∶1)為溶劑進行超聲及快速溶劑萃取結果發現:雄黃及含雄黃中成藥經酸液和甲醇提取后，均僅有As(Ⅲ)和As(Ⅴ)兩種價態，未發現含有砷膽堿、砷甜菜堿、一甲基砷和二甲基砷。As(Ⅲ)和As(Ⅴ)是毒性較大的兩種砷形態，但在中藥復方中也是起療效的兩種形態［14］，因此有必要對其進行深入研究，擬訂適當的限量，完善該類藥物的質量控制，以保證用藥安全有效。

表5結果中雄黃和水飛雄黃可溶性砷的量相差約5倍，可能與雄黃經水飛后其粒度非常細小，可溶性砷隨之增加;該現象與傳統觀念認為水飛工藝是減少可溶性砷的觀念有較大差異，但與目前通過減小雄黃粒度采用新型納米雄黃制劑治療血液系統疾病的原理一致［16］，說明雄黃經水飛的目的并非降低其可溶性砷的量，本課題組的相關研究表明雄黃經水飛后，其伴生元素如鉛、鐵等含量大大降低，可能是雄黃經炮制后降低毒性的原因之一。

3.2 不同制劑中雄黃可溶性砷形態比較 模擬人體環境提取可溶性砷中As(Ⅲ)和As(Ⅴ)之和與可溶性砷總量結果比較顯示，雄黃藥材及其炮制品中兩者接近，但在含雄黃中成藥兩者因品種不同而差別較大，有些制劑中檢測到As(Ⅲ)和As(Ⅴ)之和僅為可溶性砷總量的53.98%(見表8)，說明雄黃單獨口服在體內溶出的只有As(Ⅲ)和As(Ⅴ)，雄黃的復方制劑中其他成分使溶出的砷形態發生轉化，但并未形成目前已知6種價態的砷，推測形成其他砷大分子復合物，這類砷復合物是否能被人體吸收或者可降低其對人體的毒性，有待進一步深入研究。

表8中采用有機溶劑甲醇-水提取的可溶性砷As(Ⅲ)和As(Ⅴ)均高于模擬體內結果，推測有機溶劑提取過程一些有機價態的砷或砷復合物被提取，而后轉化為As(Ⅲ)或As(Ⅴ)，具體轉化如何發生還有待進一步研究。

3.3 含雄黃制劑可溶性砷限量探討 雄黃及其中藥復方制劑中砷的總量遠遠超過了國際上規定的人日攝入砷量的標準，但采用人工胃液提取的酸可溶性砷僅為其總量的0.13%～2.7%，表9根據各樣品服用量并結合其處方量及上述實驗結果，計算酸可溶性砷日攝入量。結果表明，大多數樣品酸可溶性總砷的攝入量小于食品添加劑聯合專家委員會(JECFA)的安全限量 (0.128 mg/(人·d－1)，但也有3個樣品超出該限量，其酸可溶性砷中As(Ⅲ)+As(Ⅴ)的日攝入量小于酸可溶性總砷日攝入量。

表9 雄黃及其成方制劑中日攝入最大酸可溶性砷量Tab.9 Daily intake of the realgar and its preparations

酸可溶性砷及其形態日攝入量超出安全限量并不能說明其毒性大，本課題組對雄黃大鼠體內代謝初步研究結果顯示，砷進入體內大多數會排泄出體外，另外一部分經人體吸收的砷經體內酶作用均轉化為毒性較小的一甲基砷，因此對于含雄黃中藥可溶性砷限量應根據具體品種結合體內毒性試驗進行深入研究。

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