大鼠皮膚中青藤堿的HPLC測定

朱谷晶， 鄭杭生， 王肖龍， 陶建生

(1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海201203;2.浙江中醫藥大學，浙江杭州310053;3.上海中醫藥大學中藥學院，上海201203)

青藤堿 (sinomenine，Sin)系從防己科植物青風藤 Sinomenium acutum(Thunb.)Rehd.et wils.及毛青藤 Sinomenium acutum(Thunb.)Rehd.et wils.var.cinereum(Diels)Reht.et Wils的根莖提取，藥用多為鹽酸青藤堿 (sinomenine hydrochloride)，分子式為C9H2304·HCl，結構見圖1，它具有抗炎、鎮痛、抑制免疫、降壓及抗心率失常等作用［1］，目前臨床主要用于治療類風濕性關節炎，其口服不良反應較多［2］，且生物半衰期較短［3］，需頻繁給藥［4］，故有必要進行新劑型與新給藥途徑的研究以彌補上述缺點。鹽酸青藤堿外用制劑通過透皮吸收，在起到袪風通絡、散寒除濕、止痛消炎作用的同時，可以避免肝臟和胃腸道對藥物的破壞，降低藥物的毒副反應，且給藥方便。皮膚外用制劑應用后皮膚中的藥物含有量的監測對于闡明制劑的起效時間、作用持續時間以及藥物經皮滲透機制有重要意義，故本實驗建立了一種高效液相色譜法用于測定皮膚中青藤堿，方法快速、精密、準確。

圖1 鹽酸青藤堿的化學結構Fig.1 Chemical structure of sinomenine hydrochloride

1 儀器和材料

1.1 儀器 LC-2130高效液相色譜儀 (上海天美公司);低速離心機 (上海安亭科學儀器公司);BS124 S電子天平 (德國薩多利斯公司)。

1.2 材料 青藤堿對照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號:0774-200206);鹽酸昂丹司瓊 (ondansetron hydrochloride，Ond-HCl)(純度99.9%，浙江黃巖延年制藥廠，批號:011213);青藤堿傳遞體混懸液 (自制，處方主要輔料包括大豆磷脂、膽固醇、維生素E與脫氧膽酸鈉);甲醇為色譜純;HPLC用水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

1.3 動物 SD大鼠，雄性，體質量 (200±20)g，上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號SCXK(滬)2007-0005。

2 分析方法的建立

2.1 對照品溶液的配制 精密稱取青藤堿對照品5.05 mg，用流動相溶解，配制成0.202 mg/mL的對照品溶液，4℃保存。

2.2 色譜條件 C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm，Kromasil);流動相為甲醇-水-乙二胺(55∶45∶0.225)混合液;體積流量1.0 mL/min;檢測波長265 nm;柱溫30℃;定量環定量進樣20 μL。

2.3 鼠皮的制備 取正常進食可自由飲水的未給藥大鼠，過量乙醚麻醉致死，剔除腹部的毛并取下該部位的皮膚。將取下的皮膚平鋪于玻璃板上，角質層朝下，除去皮下組織，用生理鹽水沖洗干凈，將皮膚展平后置于兩玻璃板之間，加少量生理鹽水浸潤皮膚，最后置于自封袋中，密閉放于冰箱(－40℃)中保存，備用。

2.4 堿化液的配制 精密稱取1.060 g碳酸鈉，溶解于100 mL純凈水中，標記為A溶液，精密稱取0.840 g碳酸氫鈉，溶解于100 mL純凈水中，標記為 B溶液，取 A溶液 87.9 mL，B溶液12.1 mL，混合，即得碳酸鹽緩沖溶液，測得pH=10.84，常溫下保存。

2.5 空白皮膚樣品處理 空白皮膚樣品的處理與分析主要用于考察分析方法的專屬性、線性關系、精密度、準確度與樣品穩定性等。取空白皮膚樣品，在室溫下自然解凍，剪取1 cm2，置于研磨器中，加入200 μL碳酸鹽緩沖液 (pH=10.84)，根據需要加入200 μL內標物鹽酸昂丹司瓊溶液(19.6 μg/mL，水溶液)，充分研磨，得皮膚勻漿。加入3 mL提取溶劑正己烷－二氯甲烷－異丙醇(100∶50∶5)混合液［4］，渦旋1 min，3000 r/min離心5 min后將上清液轉移至5 mL具塞塑料離心管中，于50℃下氮氣流吹干。殘留物用150 μL流動相溶解，渦旋30 s，離心后吸取20 μL上清液進樣分析。按考察項目要求記錄色譜圖，處理數據。

2.6 含藥皮膚樣品測定 將青藤堿傳遞體混懸液施用于大鼠皮膚，一定時間后取下施藥部位皮膚即得含藥皮膚樣品。取皮膚樣品，剪取合適大小，并量取尺寸，計算面積，如不足1 cm2，則以空白皮膚補足，置于研磨器中，加入200 μL碳酸鹽緩沖液 (pH=10.84)與200 μL內標物鹽酸昂丹司瓊溶液 (19.6 μg/mL，水溶液)，充分研磨，得皮膚勻漿。提取與進樣分析過程同2.5項下，將青藤堿與內標物峰面積之比代入標準曲線方程，即得皮膚樣品中青藤堿的總量，此結果再除以皮膚樣品面積即得單位面積皮膚中的量。

2.7 分析方法確證

2.7.1 標準曲線繪制 取空白皮膚1 cm2，置于研磨器，分別加入0.202 mg/mL的青藤堿對照品溶液5、10、25、50、75、100 μL(其中青藤堿對照品的量分別為 1.02、2.04、5.10、10.2、15.3、20.4 μg)之后按2.5項下操作，從“加入200 μL碳酸鹽緩沖液”至“進樣分析”，記錄色譜圖。以青藤堿與內標物峰面積之比y對相應的青藤堿對照品的量x(μg)作圖，得線性回歸方程為:y=0.0767x－0.0081，R =0.9983，線性范圍為1.02～20.4 μg(青藤堿對照品的量)。

2.7.2 方法專屬性試驗 制備以下4個皮膚樣品:(1)空白皮膚1 cm2;(2)空白皮膚1 cm2加200 μL內標物溶液 (19.6 μg/mL，水溶液);(3)空白皮膚1 cm2加50 μL青藤堿對照品溶液;(4)0.2 mL青藤堿傳遞體混懸液 (相當于青藤堿1.3 mg)應用12 h后的皮膚樣品。按2.5項下操作從“加入200 μL碳酸鹽緩沖液”至“進樣分析”，各樣品的色譜圖見圖2，由圖可見，皮膚中內源性物質不干擾測定，內標物出峰時間合適并與青藤堿的色譜峰完全分離。

2.7.3 方法的精密度與準確度試驗 取空白皮膚1 cm2，加入不同體積青藤堿對照品溶液制備低、中、高含有量 (2.04 μg、10.2 μg、20.4 μg)的質量控制 (quality controll，QC)樣品 (5樣本)，按2.5項下方法從“加入200 μL碳酸鹽緩沖液”預處理至“進樣分析”，連續測定5 d，分別計算日內與日間不同含有量下青藤堿與內標物峰面積比的RSD，即為日內與日間精密度，結果表明，低、中、高樣品的日內精密度為 5.9%、7.2%、6.5%，日間精密度為4.3%、5.0%、0.8%，方法的精密度良好。將QC樣品中測得青藤堿的量(代入回歸曲線方程計算得到)與配制溶液時加入青藤堿的量相對照 (計算相對回收率)，求得本法的準確度［5］，結果表明，低、中、高樣品的相對回收率為92.6% ～104.6%，RSD為2.2% ～3.0%，方法的準確度良好。

圖2 青藤堿與內標物鹽酸昂丹司瓊的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of sinomenine and the internal standard ondansetron hydrochloride

2.7.4 提取回收率試驗 取空白皮膚1 cm2，加入不同體積青藤堿對照品溶液制備低、中、高含有量(2.04 μg、10.2 μg、20.4 μg)的 QC 樣品，每個含有量下進行3樣本分析，按2.5項下方法預處理至“進樣分析”，記錄峰面積。另取空白皮膚1 cm2，按2.5項下方法從“加入200 μL碳酸鹽緩沖液”預處理至“轉移至5 mL具塞塑料離心管中”，得到的有機層中加入相對應的不同體積的對照品溶液，于50℃下氮氣流吹干，殘留物用150 μL流動相溶解，渦旋30 s，離心后吸取20 μL上清液進樣分析，得到相應峰面積值，每個含有量下平行測定3份。以每一青藤堿對照品加入量兩種處理方法的峰面積比值計算提取回收率［5］。結果表明，低、中、高含有量樣品的提取回收率為73.9%～87.9%，符合生物樣本定量測定提取回收率的要求。同法測定內標物鹽酸昂丹司瓊的提取回收率(考察一個加樣量200 μL ×19.6 μg/mL)，結果表明，內標物鹽酸昂丹司瓊的提取回收率為80.1%～86.6%，符合要求。

2.7.5 樣品穩定性試驗 取空白皮膚1 cm2，加入不同體積青藤堿對照品溶液 (對應青藤堿對照品的量分別為 2.04 μg、10.2 μg、20.4 μg)，制成QC樣品，按2.5項下方法從“加入200 μL碳酸鹽緩沖液”預處理至“殘留物用150 μL流動相溶解”，室溫下放置24 h測定，以考察處理后的青藤堿皮膚樣品在室溫下的穩定性［5］。同法配制不同青藤堿含有量的QC樣品，經反復3次－20℃冷凍，室溫解凍后，測定樣品，以考察樣品在冷凍和解凍過程中的穩定性［5］。每一含藥量進行3樣本分析。穩定性以皮膚樣品中青藤堿的測得量與加入量之間的相對回收率表示。結果見表1，低、中、高含有量樣品，復溶后的供試品溶液在室溫下放置24 h，相對回收率分別為 97.9%、111.5%、104.0%，表明24 h內復溶的供試品溶液穩定;皮膚樣品冷凍-解凍循環3次相對回收率分別為96.0%、102.8%、107.4%，表明皮膚樣品冷凍-解凍循環3次基本穩定。

表1 樣品穩定性Tab.1 Results of the stability experiments

2.8 皮膚中藥物測定 取正常進食可自由飲水的健康雄性SD大鼠3只，適量乙醚麻醉后固定于鼠板，剔除腹部的毛并將0.2 mL青藤堿傳遞體混懸液 (相當于青藤堿1.3 mg)均勻的涂布于2 cm2的皮膚范圍內，12 h后用過量乙醚使大鼠麻醉致死，同2.3項下取下施藥部位的皮膚，用蒸餾水沖洗皮膚以去除表面吸附的藥物，按2.6項下進行測定，結果表明，3只大鼠的測定皮膚中藥物的含有量分別為 33.08、38.53、31.21 μg/cm2。

3 結論與討論

3.1 本實驗建立了一種大鼠皮膚中青藤堿測定的HPLC方法，采用內標法，在青藤堿的HPLC測定中本實驗首次采用鹽酸昂丹司瓊 (Ond-HCl)作為內標物，內標物的峰可與內源性成分和青藤堿實現基線分離，與咖啡因作內標相比，可以縮短分析時間［6］。經方法學驗證表明:皮膚中的內源性物質對測定無干擾;測定取樣皮膚中青藤堿含有量在1.02～20.4 μg的范圍內與藥物峰面積和內標物峰面積之比呈良好的線性關系;方法精密度、準確度、提取回收率、穩定性均符合生物樣品分析要求。有關青藤堿在生物樣品血清、血漿與尿液中的分析測定均已有文獻報道［7-9］，但在皮膚樣品中的測定未見報道，故本實驗進行了相關的研究。

3.2 因為皮膚為一個比較特殊的生物樣本，其中藥物濃度與其表面是否施藥有直接關系，所以藥物皮膚應用后關注的也是施藥范圍內皮膚的藥物濃度。皮膚中藥物濃度該如何表示呢?本課題組認為質量/質量分數或質量/體積分數不太適合表示皮膚中的藥物濃度，因為藥物在施藥皮膚中的縱向分布(角質層→活性表皮→真皮層→皮下組織)是不均勻的，多數藥物主要是分布在表皮，尤其是角質層中，形成藥物儲庫［10］，同時，制備皮膚樣品時涉及到去除皮下組織的操作，這個操作中皮下組織去多去少對質量/質量分數或質量/體積分數表示的濃度會有較大影響，所以采用單位面積皮膚中藥物的量 (質量/面積分數)來表示皮膚中藥物的濃度，這樣可以避免皮膚樣品制備上厚度不一致對結果造成的影響。

3.3 根據文獻［11-13］考察了甲醇-水-乙二胺(55∶45∶0.225)混合液，甲醇-0.005 mol/L磷酸氫二鈉水溶液 (55∶45)混合液，乙腈-水 (14∶86)混合液3種流動相系統，結果發現流動相為甲醇-水-乙二胺 (55∶45∶0.225)混合液時，青藤堿及內標物色譜峰峰形均較好，不拖尾，保留時間適宜，鼠皮內源性物質無干擾，所以選擇此流動相系統。

3.4 鹽酸青藤堿對溫度不穩定、受熱易氧化變黃［14］，故本實驗在皮膚樣品的前處理中采用研磨勻漿，為一種物理方法，與具有強烈腐蝕性與氧化性的化學物質 (如高氯酸)處理法相比，有利于藥物的穩定。

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