HPLC法測定蟾酥中4種蟾毒內酯

徐玲玲， 蔡國琴， 敬應春， 張 聰*

(1.上海市中醫藥大學，上海201203;2.上海市中藥研究所，上海201400)

蟾酥為蟾蜍科動物中華大蟾蜍Bufobufogargarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的干燥分泌物，經加工干燥制成［1］。其功效有解毒、鎮痛、強心、抗腫瘤、開竅醒神等作用［2-6］。蟾酥作用廣泛，藥理活性較強，其有效成分為一些骨架相同的甾體化合物，總稱蟾毒內酯［7］。

《中國藥典》2010年版一部規定了用高效液相色譜法測定蟾酥中脂蟾毒配基和華蟾酥毒基的標準，規定其總量不得少于6.0%。考察相關文獻，多是對蟾酥中脂蟾毒配基和華蟾酥毒基2個指標的測定［8-11］，而國內外同時對4種蟾毒內酯測定的報道則較少［12-13］。本實驗采用超聲提取，提取方式簡便快捷，HPLC法同時對蟾酥中蟾蜍他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基4個指標成分進行了測定，并對不同來源蟾酥藥材中的這4個指標成分進行檢測。這4種蟾毒內酯既是有毒成分又是活性成分，對其合理精確監控有其實際意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent1200高效液相色譜儀 (VMD檢測器);Agilent1100高效液相色譜儀 (DAD檢測器);島津LC—10ATVP高效液相色譜儀 (SPD檢測器);CQ—250型超聲波清洗器 ［(33±3)kHz，250 W，上海新超超聲波儀器有限公司］;TGL—16C臺式離心機 (上海安亭科學儀器廠);BS224S電子天平 (Sartorius);Milli—Q超純水機 (Milli—Pore)。

1.2 材料 蟾毒靈 (bufalin，批號:1044-100412，江西本草天工科技有限公司，純度≥98%);蟾蜍他靈 (bufotalin，批號:E-0532，天津藥物研究院，純度≥98%);華蟾酥毒基(cinobufagin，批號:110803-200605，中國藥品生物制品檢定所);脂蟾毒配基 (resibufogenin，批號:110718-200507，中國藥品生物制品檢定所)。

蟾酥藥材，共10批，均從上海華宇藥業有限公司購進。

試劑:乙腈 (HPLC級，Merck);CF3COOH(CP，純度≥99%，國藥化學試劑有限公司);甲醇 (AR，國藥化學試劑有限公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相A為乙睛，B為0.04%三氟乙酸溶液，0～5 min，B相從90%線性改變至85%，5～15 min，B相從85%線性改變至70%，15～30 min，B相從70%線性改變至60%，30～40 min，B相從60%線性改變至32%，40～45min，B相從32%線性改變至20%，45～50 min，B相保持20%;體積流量1.0 mL/min;柱溫35℃;檢測波長296 nm;進樣量20 μL。

2.2 對照品、供試品溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取蟾蜍他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對照品置五氧化二磷干燥器中真空干燥24 h;分別取各對照品約10 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇適量溶解，定容，制成各對照品貯備液。

分別精密量取蟾蜍他靈貯備液5 mL、蟾毒靈貯備液7 mL、華蟾酥毒基貯備液15 mL、脂蟾毒配基貯備液5 mL，置50 mL量瓶中，混勻，用甲醇定容至刻度，作為混合對照品貯備液 (含蟾蜍他靈40.29 μg/mL、蟾毒靈 58.00 μg/mL、華蟾酥毒基 126.48 μg/mL、脂蟾毒配基 43.68 μg/mL)。

精密量取5 mL混合對照品貯備液，置10 mL量瓶中，加水至近刻度，冷至室溫，定容，搖勻，作為混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取蟾酥藥材細粉25 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，超聲提取30 min，冷至室溫，再次定容，搖勻，離心 (12000 r/min，10 min)，上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.3 專屬性和系統適用性實驗 取混合對照品溶液、供試品溶液按上述色譜條件進樣檢測，采集DAD三維圖譜，結果表明，各指標成分色譜峰理論塔板數均大于20000、分離度均大于2.0、峰純度均大于995。相關圖譜見圖1。

圖1 對照品溶液 (A)和供試品溶液 (B)的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of referance substances(A)and sample solution(B)

2.4 線性關系實驗 精密吸取混合對照品溶液(含蟾蜍他靈 26.075 μg/mL、蟾 毒靈 49.635 μg/mL、華蟾酥毒基 50.25 μg/mL、脂蟾毒配基51.8 μg/mL)2、10、20、40、100 μL 注入液相色譜儀，按上述色譜條件進行測定，以各指標成分進樣量 (μg)為橫坐標，峰面積 (mAU*S)為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程、相關系數以及線性范圍。

蟾蜍他靈回歸方程為:y=674.85x +0.4231，R2=1，在0.05 μg ～2.61 μg 范圍內線性關系良好。蟾毒靈回歸方程為:y=732.02x+0.8528，R2=1，在 0.10 μg ～ 4.96 μg 范圍內線性關系良好。華蟾酥毒基回歸方程為:y=779.63x+2.44，R2=1，在0.10 μg ～5.03 μg 范圍內線性關系良好。脂蟾毒配基回歸方程為:y=655.34x+0.6777，R2=1，在0.10 ～5.18 μg范圍內線性關系良好。

2.5 儀器精密度實驗 取混合對照品溶液，按上述色譜條件重復進樣6次，以各指標成分色譜峰的峰面積計算蟾蜍他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的RSD值分別為0.06%、0.04%、0.11%、0.04%，結果表明儀器精密度良好。

2.6 中間精密度實驗 取同一批蟾酥藥材粉末(批號:H2010070606)，按上述方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，考察不同人員、不同時間、不同儀器測定結果的精密度。結果表明，不同時間、不同人員、不同儀器蟾蜍他靈測定結果的RSD分別為1.48%、0.82%、0.60%，蟾毒靈測定結果分別為0.31%、0.77%、1.12%，華蟾酥毒基測定結果分別為0.49%、0.74%、1.62%，脂蟾毒配基測定結果分別為0.54%、0.85%、1.16%，4種指標成分的RSD值均小于2.0%，該方法的中間精密度符合規定。

2.7 重復性實驗 取同一批蟾酥藥材粉末，按上述方法制備供試品溶液，平行制備6份，在上述色譜條件下進行測定，結果顯示蟾蜍他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的RSD值分別為0.33%、0.46%、0.47%、0.51%，結果表明該方法重復性良好。

2.8 穩定性實驗 取同一份蟾酥供試品溶液，按上述色譜條件，分別在制備后0、4、8、12、24、48、72 h測定，以各指標成分色譜峰的峰面積計算，蟾蜍他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的 RSD值分別為 0.40%、0.39%、0.21%、0.29%，結果表明樣品在72 h內的穩定性良好。

2.9 加樣回收率實驗 取蟾酥藥材 (批號:H2010070606)粉末5 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，精密加入混合對照品貯備液2.0 mL(含蟾蜍他靈40.29 μg/mL、蟾毒靈 58.00 μg/mL、華蟾酥 毒 基 126.48 μg/mL、脂 蟾 毒 配 基 43.68 μg/mL)，補水2.0 mL，搖勻，冷至室溫，用50%甲醇定容至刻度;超聲提取30 min，冷至室溫，再次定容，搖勻，離心 (12000 r/min，10 min)，上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下測定，蟾蜍他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的平均加樣回收率分別為97.62%、97.34%、97.23%、97.34%，RSD 值 分 別 為1.43%、1.59%、1.74%、1.55%。相關數據見表1～表4。

表1 蟾蜍他靈回收率實驗結果Tab.1 Results of recovery tests of bufotalin

表2 蟾毒靈回收率實驗結果Tab.2 Results of recovery tests of bufalin

表4 脂蟾毒配基回收率實驗結果Tab.4 Results of recovery tests of resibufogenin

2.10 樣品測定 取10批蟾酥藥材，按2.2.2項方法制備供試品溶液，按2.1項色譜條件測定，并按外標一點法計算藥材中各指標成分含有量。測定結果見表5。

表5 不同來源10批蟾酥藥材測定結果Tab.5 Results of content determination of Bufonis Venom from different sources

10批藥材測定結果顯示，藥材中蟾蜍他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基含有量相對穩定，脂蟾毒配基含有量則波動較大，批號為H2010020107的蟾酥藥材中脂蟾毒配基含有量小于1%，含有量明顯偏低，批號為 H2007092002、H2010062301、H2006080102的蟾酥藥材中脂蟾毒配基含有量都高達5%以上，對比之下，不同來源的蟾酥藥材中脂蟾毒配基的含有量不穩定，差異較大。

根據目前的結果可暫定各指標成分含有量限度為:按干燥品計蟾蜍他靈應不小于1.0%、蟾毒靈應不小于2.0%、華蟾酥毒基應不小于4.0%、脂蟾毒配基應不小于0.9%。

3 討論

3.1 提取條件的選擇 比較回流與超聲2種提取方式的提取效果，從實驗結果得知回流提取和超聲提取效果沒有明顯差別，考慮到實驗操作的簡便快捷，故選擇超聲提取作為提取方法，超聲時間為30 min。考察采用超聲提取的提取方式后，比較不同比例甲醇 (甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇)、不同比例乙醇 (乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇)以及水為溶劑的提取效果，從數據對比結果來看，甲醇提取效率整體優于乙醇，綜合考慮峰數目和主峰面積大小，故選擇50%甲醇作為提取溶劑。

3.2 色譜條件的選擇 比較 TC-C18、SB-C18、XDB-C18、Kromasil C18以及 Extend-C18等5款色譜柱的分離效果，結果表明，SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱最為適合該檢測方法，故用此色譜柱作為測定用分析柱。比較乙腈-1.0%甲酸溶液、乙腈－5.0%乙酸溶液、乙腈-0.04%三氟乙酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液、以及乙腈－0.5%磷酸二氫鉀溶液 (pH=3.2)、乙腈-10 mmol/L醋酸鈉溶液 (pH=3.21)為流動相體系時的分離效果，結果表明，乙腈-0.04%三氟乙酸溶液的分離效果最好，故選用此體系作為流動相。比較25℃、30℃、35℃、40℃等四種不同色譜柱溫度下的分離效果，結果表明，35℃時分離效果最佳，因此確定柱溫為35℃。

3.3 測定波長的選擇 根據蟾蜍他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的紫外光譜的吸收特征，從DAD三維圖譜中提取蟾酥對照品的UV光譜，最大吸收波長主要集中在290到310 nm之間，在《中國藥典》2010年版一部蟾酥項下含量測定采用的檢測波長296 nm處，能兼顧各成分的檢測靈敏度，因此確定測定波長為296 nm。

3.4 方法評價 本實驗采用超聲提取的方式，實驗方法簡便快捷，結果穩定可靠，通過對不同來源蟾酥藥材中的4種指標成分的含有量測定，對蟾酥的質量標準以及合理使用中藥蟾酥提供了依據，對含有蟾酥成分的六神丸、麝香保心丸等的合理應用提供了參考［14］。

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