丹參注射液中糖類(lèi)化學(xué)成分在制備工藝條件下的轉(zhuǎn)化

鄭云楓， 彭國(guó)平， 程建明， 丁 寧

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210029)

丹參注射液是由單味丹參藥材制成的中藥注射劑，具有活血化瘀、理氣開(kāi)竅之功效，臨床常用于治療冠心病、心絞痛［1］。化學(xué)成分研究表明，丹參及其制劑中主要含有酚酸類(lèi)及二萜醌類(lèi)活性成分［2-5］，相對(duì)而言丹參糖類(lèi)成分的研究目前尚未深入。

為了進(jìn)一步明確丹參注射液中化學(xué)成分組成，充分保證其質(zhì)量可控及制劑安全，依據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局 (SFDA) 《中藥注射劑安全性再評(píng)價(jià)質(zhì)量控制評(píng)價(jià)技術(shù)原則》相關(guān)要求［6］，針對(duì)丹參注射液中糖類(lèi)成分開(kāi)展了化學(xué)成分研究，在此基礎(chǔ)上還對(duì)水蘇糖在生產(chǎn)工藝條件下的轉(zhuǎn)化進(jìn)行了初步研究。

1 儀器及材料

AC—500型核磁共振儀 (瑞士 BRUKER公司);MARINER 5140質(zhì)譜儀 (美國(guó)AB公司);液相分析用Waters 510型液相色譜儀;Phecda—NH2柱 (5 μm，250 mm×4.6 mm，江蘇漢邦科技有限公司);EC—2000色譜工作站 (大連依利特分析儀器有限公司)。中壓柱層析用BUCHI B—688中壓系統(tǒng)，填料為氨基鍵合硅膠 (日本三菱公司，50～60 μm);D101型大孔吸附樹(shù)脂 (滄州寶恩化工有限公司);葡聚糖凝膠(Sephdex LH—20);乙腈為色譜純 (MERCK);甲醇為色譜純 (淮陰精細(xì)化工研究院所);三乙胺為分析純 (國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);水為亞沸蒸餾水;其余試劑均為分析純。

丹參注射液由上海華源安徽錦輝制藥有限公司提供 (批號(hào):05110209);水蘇糖對(duì)照品 (SIGMAALDRICH，851787)，甘露三糖對(duì)照品 (SIGMAALDRICH，021654)，葡萄糖對(duì)照品 (110833-200904)，果糖對(duì)照品 (100231-200303)中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 糖類(lèi)化學(xué)成分研究

2.1.1 精制與分離 取丹參注射液5 L，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3，過(guò)濾，濾液上 D101型大孔樹(shù)脂(5 L)，收集流出液，調(diào)節(jié)pH至7，濃縮;濃縮液上中壓柱色譜 (填料為氨基鍵合硅膠)，依次用90%、80%、70%、60% 乙 腈 水 溶 液 (各2000 mL)梯度洗脫，洗脫液分別收集，每100 mL為1流份，HPLC分析，合并含相同成分流份，再經(jīng)葡聚糖凝膠色譜純化，得化合物1(160 mg)，化合物2(60 mg)，化合物3(80 mg)，化合物4(100 mg)。

2.1.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:白色粉末，高分辨質(zhì)譜 (ESI-TOF/MS)測(cè)定m/z:665.2093［M-H］－，確定分子式為C24H42O21。在質(zhì)譜圖中還可見(jiàn)幾個(gè)特征碎片離子，分別為 485.1698［M-162-H2O-H］－，341.1017［M-2 × 162-H］－，179.0596［M-3×162-H］－，根據(jù)分子離子失去的中性碎片來(lái)推測(cè)，化合物1是由4個(gè)六碳醛糖組成的低聚糖。

單糖種類(lèi)的分析:取化合物1，采用酸水解法進(jìn)行水解，而后用HPLC法與已知的單糖進(jìn)行對(duì)照，確定化合物1中含有果糖、葡萄糖及半乳糖。

連接順序及方式:化合物1的13C-NMR譜中見(jiàn)有24個(gè)碳原子，結(jié)合DEPT譜及HSQC譜，可以確定其中含有1個(gè)季碳，18個(gè)CH，5個(gè)CH2，1HNMR譜中見(jiàn)有明顯的三個(gè)糖的端基碳上的氫信號(hào):5.19(1H，d，J=3.65)，4.66(1H，d，J=3.20)，4.70(1H，d，J=3.35)，其偶合常數(shù)均處在2～4 Hz之間，提示糖與糖之間的連接的苷鍵構(gòu)型為α型。H-H COSY和HMBC譜中顯示其主要相關(guān)信號(hào)見(jiàn)表1。根據(jù)以上信息，提示化合物1為“D-半乳糖1α→6-D-半乳糖 1α→6-D-葡萄糖 1α→2β-D-果糖”，檢索為水蘇糖。

為了確證以上推測(cè)的結(jié)果，用水蘇糖對(duì)照品進(jìn)行了HPLC分析，結(jié)果顯示化合物1的Rt值與其一致，故鑒定化合物1為水蘇糖，見(jiàn)表1。

化合物2:白色粉末，高分辨質(zhì)譜 (ESI-TOF/MS)在裂解電壓為+30 V時(shí)，可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰m/z:527.1588［M+Na］+，確定分子式為C18H32O16;當(dāng)質(zhì)譜裂解電壓增強(qiáng)至+100 V時(shí)，圖中除了準(zhǔn)分子離子峰外，還可見(jiàn)典型碎片離子365.0961［M-162+Na］+和203.0472［M-2×162+Na］+，據(jù)此推測(cè)，化合物2是由3個(gè)六碳醛糖組成的低聚糖。采用酸水解法進(jìn)行單糖種類(lèi)分析，結(jié)果顯示化合物2由一分子葡萄糖和兩分子半乳糖組成，推測(cè)為甘露三糖。為了確證以上推測(cè)的結(jié)果，采用甘露三糖對(duì)照品進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果顯示兩者Rt值一致，故鑒定化合物2為甘露三糖。

表1 化合物1的NMR數(shù)據(jù) (DMSO，500 MHz)Tab.1 NMR data of compound 1(DMSO，500 MHz)

化合物3:白色粉末，高分辨質(zhì)譜 (ESI-TOF/MS)測(cè)得m/z:203.0631［M+Na］+，確定分子式為C6H12O6。HPLC分析其與果糖對(duì)照品的Rt值一致，故鑒定化合物3為果糖。

化合物4:白色粉末，高分辨質(zhì)譜 (ESI-TOF/MS)測(cè)得m/z:203.0353［M+Na］+，確定分子式為C6H12O6。HPLC分析其與葡萄糖對(duì)照品的Rt值一致，故鑒定化合物4為葡萄糖。

2.2 生產(chǎn)工藝條件下水蘇糖轉(zhuǎn)化 對(duì)丹參藥材及其制劑中糖類(lèi)成分分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，甘露三糖并非是從丹參藥材直接提取所得，而是由其它糖類(lèi)成分轉(zhuǎn)化而來(lái)。基于糖類(lèi)成分結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的規(guī)律，推測(cè)該成分可能是在生產(chǎn)過(guò)程中由水蘇糖水解轉(zhuǎn)化而來(lái)。為了驗(yàn)證，對(duì)水蘇糖在不同生產(chǎn)工藝條件下的轉(zhuǎn)化進(jìn)行了研究。

2.2.1 色譜條件 Phecda-NH2色譜柱;流動(dòng)相為乙腈-水-三乙胺 (70∶30，V/V);示差折光檢測(cè)器(RID)，柱溫30℃。

2.2.2 水蘇糖轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)?zāi)M生產(chǎn)工藝條件，將水蘇糖置3種不同pH值水溶液進(jìn)行加熱水解，檢測(cè)反應(yīng)前后溶液中的成分變化。

稱(chēng)取水蘇糖對(duì)照品20 mg，共3份，置圓底燒瓶中，分別加入pH=2、pH=6、pH=9的水溶液 (采用鹽酸或氨水調(diào)節(jié)pH)10 mL使溶解，加熱煮沸1 h，放冷。分別吸取反應(yīng)前后藥液10 μL，HPLC分析。

2.2.3 結(jié)果 HPLC-RID檢測(cè)結(jié)果如圖1。由此可見(jiàn)，不同pH值條件下反應(yīng)產(chǎn)物差異較大。當(dāng)溶液pH值為9時(shí)，水蘇糖未發(fā)生水解;pH=6時(shí)，加熱1 h可使少量水蘇糖轉(zhuǎn)化成甘露三糖和果糖;而pH值降低至2時(shí)，溶液中的水蘇糖水解明顯，水解產(chǎn)物除甘露三糖和果糖外，還可見(jiàn)其它幾個(gè)水解成分的色譜峰。水蘇糖結(jié)構(gòu)式和轉(zhuǎn)化反應(yīng)見(jiàn)圖2。

圖1 水蘇糖在不同pH條件下轉(zhuǎn)化產(chǎn)物HPLC色譜圖Fig.1 Chromatography of transformation products of stachyose in different pH solution

圖2 水蘇糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)Fig.2 Proposed transformation pathways of stachyose

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)以丹參注射液為對(duì)象，共分離鑒定了4個(gè)糖類(lèi)成分，其中水蘇糖為丹參藥材及其制劑中首次發(fā)現(xiàn)的四糖成分，其含有量在藥材中較高。文獻(xiàn)［7-11］報(bào)道，水蘇糖是一種多功能的低聚糖，具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，增殖雙歧桿菌，提高機(jī)體免疫力等作用，被稱(chēng)為“超強(qiáng)雙歧因子”。而丹參及其制劑功效廣泛，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)除了普遍認(rèn)可的酚酸及二萜醌類(lèi)成分外，所含糖類(lèi)成分如水蘇糖等是否也是活性成分，值得進(jìn)一步的研究和探討。

3.2 《中藥注射劑安全性再評(píng)價(jià)質(zhì)量控制評(píng)價(jià)技術(shù)原則》中規(guī)定，多成分制成的注射劑所測(cè)各類(lèi)成分之和應(yīng)大于總固體的80%。糖類(lèi)成分作為丹參注射液中主要類(lèi)型成分，對(duì)其進(jìn)行研究并制定相應(yīng)的控制標(biāo)準(zhǔn)，可以進(jìn)一步保證制劑的質(zhì)量穩(wěn)定和臨床用藥安全。

3.3 前期對(duì)丹參藥材中糖類(lèi)成分分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，藥材中含水蘇糖量較高，但并未檢測(cè)到甘露三糖，為了明確制劑中甘露三糖來(lái)源，本實(shí)驗(yàn)對(duì)水蘇糖在不同pH條件下的轉(zhuǎn)化進(jìn)行研究分析，結(jié)果表明水蘇糖成分在中性及酸性水溶液中加熱易水解脫去一分子果糖轉(zhuǎn)化成甘露三糖 (見(jiàn)圖2)，從而確證了制劑中甘露三糖的來(lái)源，初步闡明了丹參注射液生產(chǎn)工藝條件下水蘇糖成分的轉(zhuǎn)化［12］。本研究結(jié)果為丹參及其制劑生產(chǎn)制備過(guò)程中糖類(lèi)成分的質(zhì)量控制提供了研究基礎(chǔ)。

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