銀翹解毒丸特征圖譜初步研究

羅 曼， 周 蘭， 申 璀， 熊慧林

(貴州省食品藥品檢驗所，貴州貴陽550004)

銀翹解毒丸由金銀花、連翹、薄荷、荊芥、淡豆豉、牛蒡子 (炒)、桔梗、淡竹葉、甘草九味中藥組成，具有疏風解表，清熱解毒的功能。現(xiàn)行法定標準有:《中國藥典》2005年版一部、《中國藥典》2010年版一部、《衛(wèi)生部標準》中藥成方制劑第十四冊、 《衛(wèi)生部標準》中藥成方制劑第十九冊、國家藥品監(jiān)管局標準 (試行)WS-564(Z-110)-2002、國家藥品監(jiān)管局標準 (試行)YBZ27002005。各標準收載的檢測指標有顯微特征鑒別、薄層色譜定性鑒別及高效液相色譜定量測定等。現(xiàn)行標準收載的每種檢測指標針對性強，但覆蓋面有限，僅針對性地對方中1～2種藥味進行檢測，由于銀翹解毒丸處方藥味較多，難以反映檢測樣品的全貌，有必要建立有效手段全面評價樣品質(zhì)量。中藥指紋圖譜及特征圖譜的研究應用為更全面控制中成藥質(zhì)量提供了良好的研究前景，目前已有部分文獻報道采用指紋圖譜及特征圖譜探索成藥質(zhì)量控制研究［1-5］，但大部分指紋圖譜及特征圖譜的研究仍集中于單味藥材的質(zhì)量控制。銀翹解毒丸的研究報道主要為銀翹解毒丸定量測定研究［6-7］及處方中單味原料藥材的指紋圖譜及特征圖譜研究［8-11］，尚無銀翹解毒丸制劑特征圖譜的研究報道。根據(jù)本品法定標準收載的處方與制法模擬制備銀翹解毒丸10批，采用HPLC方法探索建立銀翹解毒模擬丸的特征圖譜，研究特征圖譜中特征峰的歸屬，為有效評價銀翹解毒丸的質(zhì)量提供了一定的研究基礎。

1 儀器和試藥

Aglient 1260液相色譜儀，Aglient 1260 DAD VL檢測器，HP液相色譜工作站。甲醇為色譜純(Tedia company)，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。參照物綠原酸 (中國藥品生物制品檢定所:110753-200413)、連翹苷 (中國藥品生物制品檢定所:110821-200609)、牛蒡苷 (中國藥品生物制品檢定所:110819-200505)。

處方中九味藥材各10批分別來源于廣西、江西、江蘇、貴州、浙江、內(nèi)蒙、湖南、陜西、河北、四川、甘肅、陜西、河南、吉林、山東、山西、新疆等地，經(jīng)本所中藥室熊慧林及貴陽中醫(yī)學院陳德媛教授鑒定均符合2010年版《中國藥典》一部［12］要求。按銀翹解毒丸質(zhì)量標準收載的處方與制法制備模擬丸劑10批，編號分別為WJ1～WJ10。

市售商品銀翹解毒丸5批，為四川省宜賓五糧液集團宜賓制藥有限責任公司產(chǎn)品2批 (批號1008021，采樣地點四川;批號1008011，采樣地點四川)，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司產(chǎn)品3批(批號0035965，采樣地點山西;批號0035967，采樣地點遼寧;批號1036303采樣地點河北)。

2 實驗方法

2.1 色譜條件 Kromasil 100-5 C18色譜柱 (4.6 mm ×250 mm);檢測波長279 nm，柱溫30℃;甲醇為流動相A，0.2%磷酸為流動相B，進行線性梯度洗脫，0～10 min，A由10%線性改變至20%，10～30 min，A線性改變至30%，30～50 min，A線性改變至37%，50～80 min，A線性改變至50%;檢測波長279 nm;體積流量1 mL/min;進樣量10 μL。理論板數(shù)按綠原酸計不低于5000。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品0.01973 g，置100 mL量瓶，加甲醇溶解稀釋至刻度;連翹苷對照品0.01362 g，置50 mL量瓶，加甲醇溶解稀釋至刻度;牛蒡苷對照品0.01058 g，置50 mL量瓶，加甲醇溶解稀釋至刻度;分別量取上述綠原酸對照品溶液2 mL，連翹苷對照品溶液1 mL，牛蒡苷對照品溶液5 mL，置同一10 mL量瓶，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液 (每1 mL各含綠原酸、連翹苷、牛蒡苷分別為 39.46 μg、27.24 μg 、105.8 μg)。對照品色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the reference substances

2.3 供試品液制備 取模擬丸劑，研細，取約4.5 g，精密稱定，置具塞錐瓶中，精密加入甲醇25 mL，超聲處理 (功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。樣品色譜圖見圖2。

圖2 銀翹解毒丸對照特征圖譜Fig.2 Standard chromatogram of simulated Yinqiao Jiedu Pills

2.4 精密度試驗 分別精密吸取同一供試品 (重復性1)溶液各10 μL，連續(xù)重復進樣6次，按2.1項下條件檢測，采用中藥色譜指紋圖譜的相似性計算軟件對6次測定結(jié)果進行計算，其相似度均為0.99以上，以綠原酸峰為對照峰，各共有峰的相對保留時間RSD值為0～0.07%，其相對峰面積的RSD值為0～0.98%，結(jié)果表明儀器等整個檢測系統(tǒng)的精密度良好，符合指紋圖譜的要求。

2.5 重復性試驗 取同一批次的供試品 (模擬丸一)共6份，精密稱定，按2.3項下制備，按2.1項色譜條件檢測，6次測定的圖譜其相似度均為0.99以上，以綠原酸為對照，各共有峰的相對保留時間RSD值為0～0.08%，其相對峰面積的RSD值為0～2.98%，結(jié)果表明同一批次的6份供試品色譜特征圖譜相似，沒有明顯的差異，方法的重復性良好，符合特征圖譜的要求。

2.6 穩(wěn)定性實驗 取2.5項下同一供試品溶液，分別在0、4、8、12、16、24 h進行檢測，獲得不同時間進樣的供試品色譜其相似度均為0.99以上，各共有峰的相對保留時間RSD值為0～0.06%，相對峰面積的RSD值為0～3.15%。結(jié)果表明，在24 h內(nèi)銀翹解毒模擬丸的特征圖譜基本穩(wěn)定，沒有明顯的變化，符合特征圖譜的要求。

2.7 銀翹解毒丸樣品標準特征圖譜的建立 比較10批模擬丸供試品溶液譜圖的相關參數(shù)，結(jié)合重復性試驗、穩(wěn)定性試驗考查結(jié)果，刪除10批樣品色譜中平均相對峰面積小于0.03的色譜峰、重復性試驗及穩(wěn)定性試驗中相對保留時間及相對峰面積RSD大于5%的色譜峰以及峰形不佳的色譜峰，發(fā)現(xiàn)色譜圖中14個峰 (包含S峰在內(nèi))為各批供試品共有，且符合特征圖譜方法考查的要求，因此確定這14個峰為其共有峰。綠原酸峰最大，選作為S峰，11號峰為連翹苷，13號峰為牛蒡苷 (見圖3)。10批模擬銀翹解毒丸樣品特征圖譜共有峰的相對保留時間較一致，RSD為0～0.10%。10批模擬銀翹解毒丸樣品特征圖譜共有峰的相對峰面積差異較大，RSD為0～99.44%。銀翹解毒丸樣品標準特征圖譜應以相對保留時間為指標建立，根據(jù)上述數(shù)據(jù)建立相應的銀翹解毒丸的特征圖譜。10批銀翹解毒丸特征圖譜與標準特征圖譜相似度在0.9以上 (見表1)。

2.8 銀翹解毒丸樣品特征圖譜特征峰歸屬 按照銀翹解毒丸質(zhì)量標準收載的制法，制備分別缺失金銀花、連翹、薄荷、荊芥、淡豆豉、牛蒡子(炒)、桔梗、淡竹葉、甘草等九味藥材的模擬陰性樣品。取上述9種陰性樣品，精密稱定，按2.3項下制備，按2.1項下條件檢測，將生成的陰性樣品圖譜與銀翹解毒丸樣品標準特征圖譜進行比較，確定特征峰的歸屬。經(jīng)圖譜比較，甘草、金銀花、連翹、牛蒡子4味藥材有明顯歸屬的色譜峰，分別為由5號，6號峰及其周圍1～3個小峰形成的組峰 (甘草)、S峰 (金銀花)、11號峰 (牛蒡子)、13號峰 (連翹)。如圖4，圖中GC-YX為缺甘草陰性樣品;GC為甘草;TYH-YX為缺金銀花陰性;LYS為綠原酸;NBZ-YX為缺牛蒡子陰性;NBG為牛蒡苷;LQ-YX為缺連翹陰性;LQG為連翹苷;YQJDW為銀翹解毒丸。

圖3 10批模擬銀翹解毒丸樣品特征圖譜Fig.3 Common chromatograms of ten batches of simulated Yinqiao Jiedu Pills

表1 銀翹解毒模擬丸樣品的標準特征圖譜相似度Tab.1 Similarity of simulated Yinqiao Jiedu Pills

2.9 樣品檢測評價 根據(jù)銀翹解毒模擬丸特征圖譜特征峰的歸屬，評價銀翹解毒丸。考慮到原料藥材產(chǎn)地、采收時間、貯存條件以及生產(chǎn)工藝參數(shù)的差異，兼顧特征圖譜適用性，僅評價抽驗樣品色譜圖中是否檢出2.8項中所述特征峰:5、6號峰及其周圍的1～2個小峰形成的組峰中的任一色譜峰(甘草)、S峰 (金銀花)、11號峰 (牛蒡子)、13號峰 (連翹)。經(jīng)考查特征圖譜重復性、穩(wěn)定性的相對保留時間和10批模擬丸劑的相對保留時間離散度很小，RSD均小于2%，故規(guī)定特征峰相對保留時間限度為±2%。根據(jù)10批次模擬丸特征圖譜特征峰的相對峰面積分布，綜合考慮樣品生產(chǎn)中多重因素的影響，確定除S峰外的特征峰的豐度最低不小于10批次模擬丸劑中相對峰面積均值的50%。

限度范圍為:應檢出S峰 (金銀花)，5號峰(甘草組峰)～6號 (甘草組峰)的相對保留時間區(qū)間內(nèi) ［1.827× (1±0.02)～1.861× (1±0.02)］至少一個相對峰面積不低于0.02的色譜峰，11號峰 (牛蒡子)相對保留時間為2.942×(1±0.02)且相對峰面積不低于0.2的色譜峰，13號峰 (連翹)為相對保留時間3.242×(1±0.02)且相對峰面積不低于0.04的色譜峰。

圖4 銀翹解毒丸特征圖譜特征峰定位Fig.4 Locating common chromatograms of Yinqiao Jiedu Pills

按本實驗特征圖譜檢測法，測定市售銀翹解毒丸5批，均檢出金銀花、甘草、牛蒡子、連翹的特征峰，如圖5。

圖5 市售銀翹解毒丸特征圖譜Fig.5 Common chromatograms of Yinqiao Jiedu Pills in market

3 討論

3.1 本實驗選擇對共有特征峰中最大的色譜峰綠原酸峰作指標考查樣品的提取時間，以甲醇超聲處理30 min的測定值最高，增加提取時間，測定值不再增加，從而確定樣品提取方法為甲醇超聲處理30 min。

3.2 本實驗探索考查了特征圖譜的色譜系統(tǒng)及檢測波長。研究中嘗試了乙腈-0.2%磷酸系統(tǒng)的梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)色譜峰保留時間不夠穩(wěn)定，色譜圖變化較大。甲醇-0.2%磷酸系統(tǒng)較穩(wěn)定，但不同梯度洗脫結(jié)果存在較大差異，經(jīng)反復試驗確定本實驗所述的流動相梯度分離效果及色譜峰形最佳。檢測波長比較了230、240、260、270、279、320 nm，發(fā)現(xiàn)279 nm波長處檢測特征色譜峰較多，各特征色譜峰相對保留時間穩(wěn)定，雜質(zhì)干擾較少，故確定279 nm為檢測波長。

3.3 中藥特征圖譜技術是目前公認的鑒別中藥品種和評價中藥質(zhì)量的有效手段，其優(yōu)點在于可全面反映中藥復雜的化學成分及其相對比例，在有效成分尚未完全闡明的情況下，可有效地表征中藥質(zhì)量。中藥色譜特征圖譜是一種綜合的，可量化的鑒別手段，是符合中藥特色的質(zhì)量控制模式之一［13］。本實驗建立了銀翹解毒丸劑特征圖譜檢測方法，由于本品組方較為復雜由九味藥材組成，10批模擬丸中的九味藥材皆來源不同 (產(chǎn)地或批次不同)，10批銀翹解毒丸劑特征圖譜共有14個共有特征峰，綠原酸峰最大，選作為S峰，牛蒡苷、連翹苷分別為樣品的11號、13號共有特征峰。從結(jié)果分析，多數(shù)的商品藥材化學成分相對穩(wěn)定，質(zhì)量較高，相似度均大于0.9。由于藥材為天然產(chǎn)物，樣品的理化成分為其在自然界產(chǎn)生的代謝物質(zhì)，其量的高低受產(chǎn)地、氣候、采收季節(jié)等因素的影響而不同，對于成藥而言影響因素還有生產(chǎn)過程中工藝參數(shù)的控制、運輸及儲存等的影響。樣品中的理化成分種類的數(shù)量則相對穩(wěn)定，僅每種物質(zhì)的含有量或相對豐度存在差異。基于上述考慮，本實驗考察了10批次的模擬丸，運用《中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》軟件分析，評價模擬丸劑圖譜與10批模擬丸劑生成的標準特征圖譜的相似性，其相似度在0.85以上。10批樣品中相對保留時間的離散度很小，14個共有特征峰的相對保留時間的RSD均在0.11%以下。10批樣品中相對峰面積的離散度較大，14個共有特征峰的相對峰面積的RSD最高可達99.44%。實驗結(jié)果表明樣品中的理化成分種類相對穩(wěn)定，而理化成分的量受多因素的影響存在較大的變化。

3.4 考慮到銀翹解毒丸批準文號較多，全國大部分地區(qū)均有生產(chǎn)企業(yè)，不同地域生產(chǎn)企業(yè)投料用原料藥材可能存在較大差異如產(chǎn)地及批次等，很難確定一個極具代表性的產(chǎn)品。基于上述原因，本實驗從全國各地收集經(jīng)鑒定符合2010年版《中國藥典》一部要求的九味原料藥材各10批，按法定標準的處方及制法自制銀翹解毒丸作為特征圖譜的探索性研究的試驗對象。本實驗中模擬丸為試驗室小試樣品與企業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)存在差異，兩者特征性的差異有待進一步研究。但作為多指標定性質(zhì)量控制方法的建立，本實驗研究具有一定的研究意義，實驗建立的特征圖譜，專屬性強，重復性好，可有效地鑒別和評價銀翹解毒丸的質(zhì)量優(yōu)劣，為全面評價銀翹解毒丸的質(zhì)量提供了一定的研究基礎。

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