大黃中4個番瀉苷類成分受熱條件下轉化關系的研究

哈 飛， 李瑞明， 張蘭蘭*， 閆希軍

(1.天津中醫藥大學，天津300193;2.天津天士力集團研究院現代中藥所，天津300410)

大黃為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.、唐古特大黃Rheum tanguticum Maxim.ex Balf或藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根及根莖［1］，始載于《神農本草經》，列為中品，因其色黃而得名［2］。大黃是中醫中傳統的瀉劑之一，致瀉的主要成分為蒽醌類化合物，其中以番瀉苷的作用最強，游離型蒽醌瀉下作用較弱。番瀉苷A和B是大黃的活性成分，韓國及日本均將番瀉苷A作為檢測指標［3］。自古研究大黃以來，大黃有在處方中需要后下之說，藥典用法有不宜久煎，都是因為加熱時間過長瀉下成分會分解［4-5］，但很少有文獻報道其具體成分轉化途徑，本實驗對大黃中主要瀉下成分番瀉苷類進行了受熱條件下轉化關系的研究，闡述了其分解途徑，對大黃在中藥制劑中的應用具有科學性指導。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀 (Waters e2695 Separations Module，Waters 2998 PDA檢測器，Empower數據處理軟件)，質譜儀 (Agilent G6300 MS TRAP)調溫電熱套 (98-1-B型)，電子分析天平 (梅特勒/XS205DU)。

1.2 試藥 大黃購于安國藥材市場，為四川大黃統貨，經天津中醫藥大學李天祥教授鑒定為藥用大黃 Rheum officinale Baill.。

番瀉苷A、B、C、D對照品 (天津馬克生物技術有限公司，批號:f-20091215)，磷酸 (天津市光復精細化工研究所，色譜純)，食用乙醇，二純水 (Milli-Q制備)，色譜乙腈 (Merck公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為乙腈 (A)-0.1%磷酸水溶液 (B)梯度洗脫，0～50 min(10% ～27%A)，50～55 min(27% ～27%A)，55～78 min(27% ～53%A)，78～83 min(53%～80%A)，83～93 min(80%A);柱溫35℃;檢測波長280 nm;體積流量1.0 mL/min。

2.2 供試品溶液制備

2.2.1 大黃原液樣品制備 以最優工藝［6］提取大黃生藥，稱取大黃生藥20.0 g，加入10倍生藥量的80%乙醇，回流提取3次，每次提取時間為0.5 h，得大黃提取液。取樣，為0時刻待測液。分別平行取6份大黃提取液，每份200 mL置于圓底燒瓶中，回流加熱，回流時間依次為10、20、30、40、50、60 min。分別取樣平行3份，以2.1項色譜條件方法檢測，比較大黃中4個番瀉苷類成分變化。

2.2.2 番瀉苷樣品制備 分別精密稱取番瀉苷A、B、C、D各2.5 mg，用80%乙醇定容于25 mL量瓶中，得0.1 mg/mL供試品溶液。取樣，為0時刻待測液。分別將供試品溶液移置50 mL燒瓶中，電熱套加熱回流，分別在10、20、30、40、50、60 min時刻取樣，得待測液，以2.1項色譜條件方法檢測。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性 分別精密吸取番瀉苷A、B、C、D對照品原溶液3、5、7、9、12、15 μL，按2.1項色譜條件，高效液相檢測，測得峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標，回歸方程分別為:YA=862384 X+421483，r=0.9995;YB=919823X －28414，r=0.9990;YC=541435X －12076，r=0.9991;YD=929651X －40147，r=0.9998。番瀉苷A、B、C、D 在0.3 μg～1.5 μg范圍內呈良好線性關系。

2.3.2 精密度實驗 分別精密吸取番瀉苷A、B、C、D對照品原溶液10 μL，按2.1項色譜條件下重復進樣6次，測得各峰面積，得其RSD值分別為0.26%、0.37%、0.45%和0.43%，表明精密度良好。

2.3.3 重復性實驗 供試品溶液每時刻分別平行取樣3份，進行測定，得番瀉苷A、B、C、D峰面積值的RSD均小于3%，表明重復性良好。

2.3.4 穩定性實驗 取番瀉苷A、B、C、D對照品原溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h在2.1項色譜條件下進行測定，峰面積的RSD值分別為1.06%、1.27%、0.95%和1.31%，表明在常溫下24 h內穩定。

2.4 結果

2.4.1 大黃提取液未加熱前HPLC色譜圖見圖1。大黃中番瀉苷A、B、C、D成分在受熱條件下均存在降解，通過對大黃中番瀉苷A、B、C、D在受熱條件下各時間點的相對峰面積進行比對，分別得到1 h內的變化趨勢，見圖2～5。

圖1 大黃提取液HPLC圖譜Fig.1 Chromatogram of rhubarb extract

圖2 番瀉苷A變化趨勢圖Fig.2 Changed trend chart of sennoside A

圖3 番瀉苷B變化趨勢圖Fig.3 Changed trend chart of sennoside B

圖4 番瀉苷C變化趨勢圖Fig.4 Changed trend chart of sennoside C

圖5 番瀉苷D變化趨勢圖Fig.5 Changed trend chart of sennoside D

2.4.2 番瀉苷A、B、C、D在受熱條件下存在相互轉化關系，在1 h內呈規律性趨勢變化，結果見圖6～9。

圖6 番瀉苷A受熱條件下1h內變化情況Fig.6 Sennoside A changes under heating condition in 1 h

圖7 番瀉苷B受熱條件下1 h內變化情況Fig.7 Sennoside B changes under heating condition in 1 h

圖8 番瀉苷C受熱條件下1 h內變化情況Fig.8 Sennoside C changes under heating condition in 1 h

番瀉苷A在1 h內80%乙醇中加熱回流條件下，可以轉化為番瀉苷B和番瀉苷C。番瀉苷B在1 h內80%乙醇中加熱回流條件下，可以轉化為番瀉苷A和番瀉苷C。番瀉苷C在1 h內80%乙醇中加熱回流條件下，可以轉化為番瀉苷B和番瀉苷D和新的中間產物。番瀉苷D在1 h內80%乙醇中加熱回流條件下，可以轉化為番瀉苷B和番瀉苷C和新的中間產物。見表1～4。

圖9 番瀉苷D受熱條件下1 h內變化情況Fig.9 Sennoside D changes under heating condition in 1 h

表1 番瀉苷A在加熱回流各時間點的峰面積百分比Tab.1 Peak area percentage of sennoside A under heating reflux condition each time

表2 番瀉苷B在加熱回流各時間點的峰面積百分比Tab.2 Peak area percentage of sennoside A under heating reflux condition each time

番瀉苷A、B、C、D化學結構式［7］見圖10。

番瀉苷A和B互為異構體，相對分子質量為862.74;番瀉苷C和D互為異構體，相對分子質量為848.74［8］。取番瀉苷D加熱60 min時刻的樣品，進行質譜檢測。番瀉苷C和D加熱下有新中間產物生成，對其進行質譜分析，對正離子碎片離子峰采集，結果如圖11，得知推測生成的中間產物的相對分子質量為834.7。

表3 番瀉苷C在加熱回流各時間點的峰面積百分比Tab.3 Peak area percentage of sennoside A under heating reflux condition each time

表4 番瀉苷D在加熱回流各時間點的峰面積百分比Tab.4 Peak area percentage of sennoside A under heating reflux condition each time

3 討論

大黃瀉下的有效成分為蒽醌類衍生物，以蒽酮苷類瀉下效力較強，游離蒽酮較弱，游離蒽醌更次。雙蒽酮比單蒽酮強，其中番瀉苷A(sennoside A)為大黃瀉下最強的有效成分［9］。因番瀉苷A加熱分解，大黃煎煮時間過長，會使瀉下作用減弱［10］。大黃中番瀉苷類成分為大黃瀉下作用的主要成分［11］，藥效作用大，但含有量較少，因此有必要對番瀉苷類單體成分進行研究，使大黃更好的在現代中藥中應用。

本實驗中，對大黃中番瀉苷類成分受熱條件下考察，番瀉苷A、B、C、D成分均有降解，為明確其降解原因，故首次將番瀉苷A、B、C、D對照品作為考察對象，更直觀的對大黃中番瀉苷類成分穩定性進行研究，揭示了番瀉苷類成分之間的轉化關系，避免了大黃中其他成分對番瀉苷類成分研究時的影響。

大黃藥材中番瀉苷總量在0.304%～1.450%之間，均值在0.892%［12］，其中含番瀉苷D較低，同時，從單體番瀉苷D受熱下轉化情況得知其降解率大，且轉化中難形成番瀉苷D，推測為大黃中番瀉苷D受熱全部降解的原因，HPLC未能檢測出。

圖10 番瀉苷A、B、C、D化學結構式Fig.10 Chemical structures of sennoside A，B，C，D

圖11 中間產物質譜圖譜Fig.11 Mass spectrum of intermediate product

結合型蒽醌以番瀉苷為主，是大黃蒽醌類衍生物以及蒽酮與葡萄糖結合形成的苷類。蒽酮糖苷進行治療時發揮作用的成分為水解后苷元的部分［13］。大黃中番瀉苷類成分的致瀉作用是因其在腸內變為大黃酸蒽酮所致，并進一步被氧化成番瀉苷元［7，14］。結合實驗結果推測，二蒽酮番瀉苷類成分在受熱條件下可斷鏈形成單蒽酮，又可再結合，形成互相轉化過程。

本實驗考察番瀉苷類成分是為大黃更好的應用為前提，大黃提取醇提法也為經典法［15］，故只考慮了80%醇中和受熱條件下其轉化關系。對于番瀉苷類成分在不同溶媒及不同pH和不同溫度條件下的變化關系，有待進一步研究。

實驗中，在質譜分析中，番瀉苷D在加熱條件下生成的新中間產物量較大，所以選擇其加熱60 min時刻進行分析。番瀉苷A和B的相對分子質量已知為862.74，番瀉苷C和D的相對分子質量為848.74，故通過質譜正離子譜圖得其中間產物分子量。

該實驗對大黃中4個番瀉苷類成分的穩定性進行研究，數據真實可靠，為大黃在中藥現代化中的應用提供可靠性指導。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:22.

［2］張向紅，程黎暉.大黃的藥理作用及臨床應用研究進展［J］.中國藥業，2009，18(21):76-78.

［3］馬 蓉，張雪菊.液相色譜法對不同產地大黃中番瀉苷A含量比較分析［J］.中成藥，2008，30(10):1489-1490.

［4］馮 萍，趙 萍.劑量、炮制和煎服方法對大黃藥效的影響［J］.實用中醫內科雜志，2004，18(3):256-258.

［5］朱詩塔，雷 鵬，李新中，等.掌葉大黃不同炮制品瀉下、止血作用的比較研究［J］.中藥材，2008，31(2):199-201.

［6］哈 飛，李瑞明，張蘭蘭.大黃濃縮干燥過程中各活性成分的穩定性［J］中國實驗方劑學雜志，2012，18(3):11-13.

［7］吳立軍.天然藥物化學［M］.5版.北京:人民衛生出版社:148-149.

［8］邱頌平.大黃的藥學與臨床研究［M］.北京:中國中醫藥出版社，2007.12:143-145.

［9］李 娟，李 堅.大黃藥理作用研究及臨床應用概況［J］.實用醫藥雜志，2006，23(9):1132-1133.

［10］岡村信幸.制備大黃煎劑時番瀉苷A及瀉下活性的變化［J］.國外醫學中醫中藥分冊，2003，25(2):98-99.

［11］鄭志華，祝 晨.HPLC測定大黃提取工藝產物番瀉苷A的含量［J］.中藥材，2004，27(12):950-951.

［12］孫 佩，李 敏.HPLC法測定大黃藥材和飲片中番瀉苷A和番瀉苷B的含量［J］.成都中醫藥大學學報，2008，31(3):51-23.

［13］王 磊，高文遠.大黃活性成分藥代動力學研究進展［J］.中成藥，2011，33(9):1571-1573.

［14］武玉清，王靜霞，周成華，等.番瀉苷對小鼠腸道運動功能的影響及相關機制研究［J］.中國臨床藥理學與治療學，2004，9(2):162-164.

［15］馬 靜，張 建，劉春華，等.大黃浸膏制備工藝研究［J］.中成藥，2011，33(3):518-521.