不同商品等級羌活中有機酸和香豆素類化合物的測定

劉衛根， 王亮生， 徐文華， 楊路存， 朱滿蘭， 周國英*

(1.中國科學院高原生物適應與進化重點實驗室，青海西寧810008;2.中國科學院植物研究所，北京100093;3.中國科學院研究生院，北京100049;4.南京農業大學，江蘇南京210095)

羌活原植物為傘形科羌活屬植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang和寬葉羌活Notopterygium franchetii H.de Boiss.，以其干燥根莖和根入藥［1］。羌活屬 Notopterygium為中國特有屬，隸屬于傘形科Umbelliferae，該屬包括5個種1個亞種［2-3］。按吳征鎰先生中國植物區系分區，羌活屬植物主要分布于中國—喜馬拉雅植物亞區的橫斷山脈地區、中國—日本森林植物亞區的黃土高原地區和青藏高原的唐古特地區［4］。

羌活不僅是羌醫藥體系中的重要藥材，而且在中、藏醫藥體系中也具有悠久的藥用歷史。藥理研究表明，羌活具有抗炎、鎮痛、散寒、祛風、除濕等多種功效，對心血管疾病、消化系統疾病也具有一定的療效［5］。揮發油、香豆素和有機酸類化合物是羌活中最主要的3大類活性成分，它們具有廣泛的生物活性，如綠原酸具有利尿抗炎等作用［6］，阿魏酸具有抗炎、抗氧化、抗凝、抗血小板聚集、擴張微血管、增加冠脈流量、解除血管痙攣、防止血壓升高等作用［7-8］，羌活醇和紫花前胡苷具有鎮痛、抗炎等作用［9-10］，這些活性成分的存在使得羌活具有獨特的藥效，因而應用廣泛。

羌活藥材商品規格按產地不同分為川羌 (四川)和西羌 (甘肅、青海等);依據藥材性狀一般劃分為蠶羌、竹節羌、大頭羌和條羌4個商品等級［1，11］，其中上部根莖粗壯，節密，呈緊密隆起的環狀，全體圓柱略彎曲，形如蠶狀者為蠶羌;節間延長，形如竹節狀，習稱竹節羌;有的根莖粗大，不規則結節狀，頂部具數個莖基，根較細，習稱大頭羌;一般認為蠶羌的質量最優，竹節羌次之，大頭羌、條羌最次。然而，這種等級劃分方法僅僅依靠其外部特征，而缺乏可靠的化學以及藥理學證據。本研究對不同商品等級野生羌活 (蠶羌、竹節羌、大頭羌、條羌)以及斷離的支根、細根(須根)中主要的有機酸和香豆素類化合物進行了測定和比較，從化學角度探討羌活藥材傳統商品等級劃分的科學合理性，為其行業標準的制定提供實驗依據，對規范和提高羌活藥材生產質量以及更有效地利用羌活藥材具有重要意義。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 戴安 (Dionex)HPLC-DAD分析系統，包括P680泵、UltiMate 3000自動進樣器、TCC—100柱溫箱、PDA—100光電二極管陣列檢測器以及Chromeleon(6.60版本)變色龍色譜工作站。

1.2 試藥 有機溶劑包括分析純甲醇、冰醋酸 (北京化工廠，中國);色譜純甲醇和乙腈 (MREDA TECHNOLOGY INC.，USA)，HPLC 級超純水由Milli-Q 超純水系統 (Millipore，Billerica，MA，USA)制備。對照品阿魏酸 (批號:110773-201012)和歐前胡素 (批號:110826-201013)購自中國食品藥品檢定研究院;補骨脂素 (批號:110322)和佛手柑內酯 (批號:110215)購自上海順勃生物工程有限公司;綠原酸 (批號:ps08072303)、紫花前胡苷 (批號:ps11032301)、異歐前胡素 (批號:ps08040301)、羌活醇 (批號ps11050601)購自成都普斯生物科技有限公司，各對照品純度均在98%以上。羌活藥材于2010年8月采自青海省班瑪縣，經中國科學院西北高原生物研究所周國英副研究員鑒定為傘形科植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang。將采回的藥材除去泥沙，自然陰干后，根據藥典所描述方法進行不同商品等級歸類，并將斷離的細根、須根單獨歸為一類進行研究。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為C18TSK gel ODS-80Ts QA(250 mm × 4.6 mm，5 μm，Tosoh Co.Ltd.，日本)。體積流量0.6 mL/min，進樣量10 μL。流動相A相為純甲醇，B相為0.3%的冰醋酸水溶液，梯度洗脫程序為:0～15 min，25% ～38%A;15～17 min，38% ～38%A;17～45 min，38% ～50%A;45～55 min，50% ～75%A;55`70 min，75% ～85%A;70～75 min，85% ～25%A，75～80 min，25% ～25%A。柱溫30℃;檢測波長336 nm(紫花前胡苷)，325 nm(綠原酸和阿魏酸)，310 nm(佛手柑內酯、羌活醇、異歐前胡素、歐前胡素)，295 nm(補骨脂素)?；旌蠈φ掌返纳V圖見圖1，樣品的色譜圖見圖2和圖3。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、補骨脂素、佛手柑內酯、歐前胡素、羌活醇、異歐前胡素各適量，以甲醇溶解，搖勻并定容，制成含綠原酸 (408.00 μg/mL)、阿魏酸 (400.00 μg/mL)、紫花前胡苷(400.00 μg/mL)、補骨脂素 (405.00 μg/mL)、佛手柑內酯 (404.00 μg/mL)、歐前胡素 (403.00 μg/mL)、羌活醇 (400.00 μg/mL)和異歐前胡素(400.00 μg/mL)的混合對照品貯備液。

圖1 混合對照品的高效液相色譜圖 (325 nm)Fig.1 HPLC chromatograms of eight reference substances at 325 nm

圖2 不同波長下蠶羌的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of silkworm Notopterygium under different wavelengths

2.3 供試品溶液的制備 參考《中國藥典》并結合文獻［12-13］，選擇以下提取條件:精密稱取羌活粉末 (過100目篩)0.4 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理 (功率250 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

圖3325 nm波長下蠶羌 (B)、竹節羌 (C)、大頭羌(D)、條羌 (E)和須根 (F)的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of silkworm Notopterygium(B)，bamboo Notopterygium(C)，irregularnodal Notopterygium(D)，striped Notopterygium(E)and fibrous roots(F)at 325 nm

2.4 線性關系考察 精密量取2.2項下的混合對照品母液5、2.5、2 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，然后采用逐級稀釋的方法，用甲醇將上述不同濃度的混標 (包括母液)分別稀釋10n倍 (n=1，2，3)，得到一系列不同濃度的混合對照品溶液。每個濃度平行進樣3針，進樣量為10 μL，以對照品濃度 (X)為橫坐標，平均峰面積 (Y)為縱坐標，繪制標準曲線，得到各對照品的回歸方程。以逐步稀釋法測得8個成分的檢測限LOD值 (S/N=3)和定量限LOQ值 (S/N=10)，結果見表1。結果表明，各對照品在對應的進樣濃度 (進樣量)范圍內，線性關系良好。

2.5 精密度試驗 分別在1 d內和連續5 d精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，在所確定的HPLC條件下重復進樣5次測定。記錄各成分色譜峰面積，計算各對照品的濃度。結果表明，混合對照品溶液中，綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、補骨脂素、佛手柑內酯、歐前胡素、羌活醇、異歐前胡素濃度的日內RSD分別為1.62%、0.49%、3.39%、0.27%、0.12%、3.33%、0.34%、1.05%，日間 RSD分別為 2.18%、0.61%、2.14%、1.96%、0.45%、1.24%、1.72%、1.98%。

2.6 穩定性試驗 精密吸取上述混合對照品溶液10 μL，分別在0、2、4、8、16、24 h 進樣分析，根據峰面積計算混合對照品溶液中綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、補骨脂素、佛手柑內酯、歐前胡素、羌活醇和異歐前胡素的濃度，RSD分別為1.97%、0.52%、1.86%、1.71%、0.64%、2.22%、1.01%、1.51%，表明24 h內8個對照品穩定性良好。

表1 8個活性成分的回歸方程、檢測限和定量限Tab.1 Regression equations，LODs and LOQs for eight standards

2.7 重復性試驗 分別稱取6份蠶羌樣品，各約0.4 g，精密稱定，制備供試品溶液，并進行測定，結果表明，綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、佛手柑內酯、羌活醇、異歐前胡素6次測定值的RSD分別為2.36%、2.17%、3.19%、1.78%、1.32%、1.56%。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取蠶羌樣品粉末0.1 g，分別精密加入已知量高、中、低3個質量濃度的對照品溶液，按供試品溶液制備方法進行操作，并按2.1項色譜條件進樣分析，計算回收率，結果如表2所示。

表2 加樣回收率試驗Tab.2 Recovery of the eight bioactive compounds

2.9 樣品測定 精密稱取不同等級羌活樣品各0.4 g，按2.3項方法制備供試液，按照2.1項下色譜條件注入液相色譜儀，每批平行測定3次，以外標法用峰面積積分值計算羌活藥材中主要成分的含有量，結果見表3。

從表3可以看出，蠶羌、竹節羌、大頭羌、條羌、須根中，綠原酸的含有量呈現下降趨勢;對于阿魏酸，除竹節羌中阿魏酸含有量略低于大頭羌外，由蠶羌到須根總體也呈現下降趨勢;綠原酸和阿魏酸二者含有量之和也呈現下降趨勢，這說明所測有機酸的含有量與其傳統等級劃分方法基本相符，根莖 (蠶羌、竹節羌、大頭羌)中的含有量高于根 (條羌、須根)。

表3 不同商品等級羌活中主要有機酸和香豆素類化合物的比較Tab.3 Comparation of the contents of the main organic acids and coumarin compounds in different commercial parts of Notopterygium incisum

紫花前胡苷含有量最高的為條羌，其次為須根，由高到底依次為條羌＞須根＞竹節羌＞大頭羌＞蠶羌。佛手柑內酯含有量最高的為須根，其次為大頭羌，由高到低為須根＞大頭羌＞條羌＞蠶羌＞竹節羌。羌活醇和異歐前胡素含有量最高的均為須根，其次為條羌。這說明，根 (須根、條羌)中這幾種常見的香豆素類化合物的含有量反而比根莖(大頭羌、竹節羌、蠶羌)中的含有量高，特別是羌活中主要的2種活性成分羌活醇和異歐前胡素在須根中的含有量要明顯高于其他部位，但傳統上須根往往被認為藥用價值低或沒有藥用價值而被直接去除，因而沒能夠有進入市場。因此，從本研究的結果來看，須根中活性成分含有量高，應當也具有較高的藥用價值，應予以充分利用。

3 討論

3.1 提取方法的選擇 本實驗比較了甲醇、乙醇、水3種提取溶劑對提取效果的影響。結果表明:用水作提取溶劑對羌活醇、異歐前胡素等極性較小化合物的提取效果不佳，色譜峰主要集中在保留時間較小的一段，且峰面積明顯小于甲醇和乙醇所提樣品。乙醇和甲醇提取時，色譜圖基本一致，但甲醇提取時總色譜峰面積大于用乙醇提取，而且甲醇有利于直接進行HPLC分析，故選擇純甲醇作為提取溶劑。

考慮到回流提取需要加熱，時間也較長，提取過程中化合物容易發生電離、氧化、水解等化學反應，使得部分化學成分隨著提取過程而損失。此外，回流提取需要的有機溶劑也較多。因此，本實驗選擇超聲提取作為提取方法。根據《中國藥典》所描述的方法及相關文獻 ［12-13］，最終選擇如下提取條件:取羌活樣品0.4 g，加甲醇50 mL超聲提取 (功率250 W，頻率50 kHz)30 min。

3.2 色譜條件的優化 在建立分析方法前，對分析香豆素常用的流動相體系進行了考察，比較了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-不同質量分數冰醋酸水溶液(0.1%、0.2%、0.3%)、甲醇-不同質量分數冰醋酸水溶液 (0.1%、0.2%、0.3%)4種體系的分離效果，通過綜合比較，最終選擇甲醇-0.3%的冰醋酸水溶液作為流動相體系，并在此基礎上進一步考察了該體系下不同柱溫 (25、30、35℃)、不同體積流量 (0.6、0.8、1.0 mL/min)對分離效果的影響，柱溫30℃，體積流量0.6 mL/min時分離效果佳。通過對照品在200～400 nm范圍內的DAD全波長掃描結果可知，綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、補骨脂素、佛手柑內酯、歐前胡素、羌活醇、異歐前胡素的最大吸收波長分別為326、323、336、295、312、302、312、310 nm，本實驗選擇336 nm(紫花前胡苷)，325 nm(綠原酸和阿魏酸)，310 nm(佛手柑內酯、羌活醇、異歐前胡素、歐前胡素)，295 nm(補骨脂素)作為檢測波長，采用多波長法同時測定各成分。

3.3 多成分測定 不同商品等級的羌活中主要有機酸和香豆素的含有量存在差異，綠原酸、阿魏酸的含有量與傳統評價方法基本一致;但紫花前胡苷、佛手柑內酯、羌活醇和異歐前胡素的含有量與傳統的以外觀形態論品質的判斷標準有一定的差異，在根 (條羌、須根)中的含有量反而高于根莖 (蠶羌、竹節羌、大頭羌)中的含有量。特別是羌活中2種主要的活性成分羌活醇和異歐前胡素在須根中的含有量要顯著高于其他部位。

本實驗按照文獻和藥典所規定的等級劃分方法將采自同一產地的野生羌活分成5個部分，選擇羌活中幾種常見且容易購買到的對照品作為定量指標，從有機酸和香豆素含有量的角度來評價不同等級間的內在品質，實驗所用樣品采自同一產地，避免了市售樣品不同產地間的差異所帶來的影響。本實驗結果對于正確認識羌活藥材的內在質量提供了實驗依據，為從化學信息的角度修訂羌活藥材的商品規格標準提供了參考。

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