葛根散等3首解酒方對急性酒精中毒小鼠Caspase3/8活性的影響

田維毅， 王文佳， 韓 潔， 王慶學， 楊 柱

(貴陽中醫學院，貴州貴陽550002)

酒精引起的健康損害已成為當代社會的一個嚴重公共衛生問題。肝臟是酒精損害的最主要臟器，近年來發現，肝細胞凋亡在酒精性肝病的發生和發展過程中具有重要作用，已成為該領域的研究熱點之一。Caspases(Cysteinyl asparate specific proteinase)是一種特異性蛋白酶，因其介導細胞凋亡而備受關注［1］。在哺乳動物細胞，Caspase以依賴線粒體和非依賴線粒體兩條途徑促進細胞凋亡，其中Caspase8和Caspase3發揮著重要作用。Caspase8是細胞凋亡的啟動者，被激活后可引起下游Caspase“瀑布式”激活，且可將凋亡信號從非依賴線粒體途徑傳遞到線粒體途徑，把死亡受體通路和線粒體通路聯系起來，放大凋亡信號;Caspase3是線粒體-細胞色素 C途徑、死亡配體和(或)受體途徑、顆粒酶B途徑的共同通路，在凋亡過程中處于核心位置，是細胞凋亡的關鍵蛋白酶和主要效應因子［2］。在前期研究中，我們初步篩選出葛根散 (金·張子和《儒門事親》)、石膏湯 (解酒驗方)、葛花解酲湯 (元·李東桓《脾胃論》)等3個經方/驗方能有效解酒防醉、保護酒精導致的肝功能損傷、緩解肝組織病理損害、減少肝細胞凋亡［3-5］。為了深入探索上述解酒方減少肝細胞凋亡的部分機制，本實驗通過復制急性酒精中毒小鼠模型，考察上述解酒方對實驗動物Caspase3/8活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級昆明種小鼠，雄性，體質量18～22 g，購自貴陽醫學院實驗動物中心［許可證號:SCXK(黔)20020001］。

1.2 主要儀器與試劑 AB135-S型梅特勒托利多電子天平(梅特勒托利多上海公司);ELx800全自動酶標儀 (美國biotek);56%(V/V)紅星二鍋頭白酒為北京紅星股份有限公司產品 (批號001215);ALT、AST檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;Caspase3及Caspase8活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 實驗藥材 實驗用方劑包括葛根散 (金·張子和《儒門事親》)、石膏湯 (解酒驗方:石膏12 g、葛根10 g、干姜6 g)、葛花解酲湯 (元·李東桓《脾胃論》)，組方藥材購自貴陽同仁堂大藥房，經鑒定為正品，按原方比例常規制備水煎劑 (生藥濃度為1 g/mL)備用。

1.4 動物分組與處理 將小鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、各方大/中/小劑量給藥組，每組15只。根據藥理實驗動物給藥折算方法，以成人常規用量折算實驗小鼠用藥量，各給藥組以不同濃度的中藥水煎劑0.2 mL/(次·只)灌胃。各方實驗給藥劑量分別為:葛根散0.2 g/0.1 g/0.05 g(生藥)/10 g(小鼠體質量);石膏湯0.1 g/0.05 g/0.025 g(生藥)/10 g(小鼠體質量);葛花解酲湯0.4 g/0.2 g/0.1 g(生藥)/10 g(小鼠體質量)，每天1次，正常對照組和模型對照組代以等量蒸餾水;根據前期摸索劑量，給藥30 min后，模型對照組和各給藥組用56%(V/V)紅星二鍋頭白酒灌胃，0.15 mL/10 g，每天1次，正常對照組代以等量蒸餾水。連續灌胃10 d，所有動物常規飼養。

1.5 小鼠活動狀況觀察 所有造模小鼠出現嗜睡、步態蹣跚、活性減少、身子發抖等狀態，其余小鼠活動正常。

1.6 小鼠血清ALT、AST水平檢測 末次灌胃12 h后開始禁食 (不禁水)，24 h后每只小鼠經眼眶采血，低溫離心制備血清，按試劑盒要求檢測ALT、AST水平。

1.7 小鼠肝組織Caspase3和Caspase8活性檢測 各組動物采血后，頸椎脫臼處死，分別取肝臟組織20～40 mg制備組織勻漿，嚴格按試劑盒說明書操作方法檢測小鼠肝組織裂解液中Caspase3/8活性。所有操作盡量在冰浴中進行。

1.8 統計分析 應用SPSS11.5軟件進行數據分析，計算結果以均數±標準差 (±s)表示，組間采用t檢驗。

2 結果

為了便于復方之間的效果分析，各項指標以各方最佳效果劑量組作為參比組。

2.1 3首解酒方對急性酒精中毒小鼠血清ALT、AST水平的影響 檢測結果見表1。

(1)模型對照組小鼠血清ALT、AST水平較正常對照組顯著升高(P＜0.01)。(2)3首復方最佳效果劑組小鼠鼠血清ALT、AST水平較模型對照組顯著降低 (P＜0.01)，但與正常對照組相比明顯較高 (P＜0.05或P＜0.01)。(3)葛花解酲湯最佳效果劑量組小鼠血清ALT、AST水平在3首復方中最低，其中ALT水平與其余2首復方差異顯著 (P＜0.01)，AST水平與其余2首復方比較無差異顯著性 (P＞0.05)。 (4)3首復方最佳效果劑量組小鼠血清ALT、AST水平與最差效果劑量組之間具有顯著性差異 (P＜0.01)，但葛花解酲湯各劑量組小鼠之間血清AST水平除外 (P＞0.05)。

表1 3首解酒方對急性酒精中毒小鼠血清ALT、AST水平的影響(±s)

表1 3首解酒方對急性酒精中毒小鼠血清ALT、AST水平的影響(±s)

注:▲為各組除去死亡動物之后實際檢測數 (動物死亡原因包括醉死和操作意外死亡);a本指標最佳效果方劑;b本方劑本指標最佳效果劑量;與正常對照組比較，*P ＞0.05，＊＊P＜0.05，＊＊＊P ＜0.01;與模型對照組比較，△ P＞0.05，△△P ＜0.05，△△△P ＜0.01;與本指標最佳效果方劑比較，§P＞0.05，§§P＜0.05，§§§P＜0.01;與本方劑最佳劑量組比較，#P＞0.05，##P＜0.05，###P＜0.01。下同。

組 別 動物/只▲ ALT/(U·L－1) AST/(U·L－1)正常對照組13 53.27 ±6.38 66.95 ±12.65模型對照組 14 177.39±14.17＊＊＊ 138.88±15.97＊＊＊葛根散大劑量組 12 95.34±11.29b＊＊△△△§§§ 100.38±10.26#中劑量組 15 106.23 ±14.87# 95.94 ±13.11b＊＊＊△△△§小劑量組 13 138.71 ±13.63### 130.55±10.20###石膏湯大劑量組 14 101.96 ±11.73b＊＊＊△△△§§§ 89.66±10.71b＊＊＊△△△§中劑量組 13 109.34 ±9.94# 100.33±10.64#小劑量組 13 167.11 ±11.99### 123.08±12.05###葛花解酲湯大劑量組 12 71.82±11.27ab＊＊△△△ 91.33±11.08#中劑量組 15 75.26 ±10.37# 96.40±11.69#小劑量組 13 96.46 ±10.28### 87.63±8.37ab＊＊△△△

2.2 葛根散等3首解酒方對急性酒精中毒小鼠Caspase3/8活性的影響 檢測結果見表2。

(1)模型對照組小鼠肝組織Caspase3/8活性較正常對照組顯著升高 (P＜0.01)。(2)3首復方最佳效果劑量組小鼠肝組織Caspase3/8活性與模型對照組比較顯著降低(P＜0.01)，但石膏湯各組肝組織Caspase3活性除外 (P＞0.05);3首復方最佳效果劑量組小鼠肝組織Caspase3/8活性與正常對照組相比明顯較高 (P＜0.01)，但葛花解酲湯各組肝組織Caspase8活性除外 (P＞0.05)。(3)葛根散最佳效果劑量組小鼠肝組織Caspase3活性在3首復方中最低，與其余2首復方差異顯著 (P＜0.01);葛花解酲湯肝組織Caspase8活性在3首復方中最低，與其余2首復方差異顯著(P＜0.05)。 (4)葛根散和葛花解酲湯劑量組間肝組織Caspase3活性差異顯著 (P＜0.01);石膏湯和葛花解酲湯劑量組間肝組織Caspase8活性差異顯著 (P＜0.01)。

3 討論

酒精性肝病 (ALD)是一種由于過度飲酒引起的中毒性肝臟疾病，在我國呈逐年上升趨勢，已成為繼病毒性肝炎后導致肝損害的第二大病因。近來研究表明，酒精是肝細胞的一種凋亡誘導劑，而肝細胞凋亡ALD的發生、發展過程中起著重要作用，已成為該領域的研究熱點之一［6］。在前期研究中，我們初步篩選出本文中葛根散、石膏湯、葛花解酲湯有效解酒防醉、保護酒精導致的肝功能損傷、緩解肝組織病理損害、減少肝細胞凋亡［3-5］。為了深入探索上述解酒方減少肝細胞凋亡的部分機制，本實驗通過復制急性酒精中毒小鼠模型，考察上述解酒方對實驗動物Caspase3/8活性的影響。Caspases(Cysteinyl asparate specific proteinase)是一種特異性蛋白酶，以執行細胞凋亡而受到廣泛關注［1］。Caspase3/8在細胞凋亡過程中發揮重要作用:Caspase8是細胞凋亡的啟動者，Caspase3在凋亡過程中處于核心位置，是細胞凋亡的主要效應因子［3-4］。ALT和AST在肝細胞中均有存在，當肝細胞膜受損或細胞壞死時，便進入血液，通過測定其在血清中的活性，即可反映肝細胞受損情況及損傷程度。表1結果顯示，模型小鼠血清ALT、AST水平顯著升高，提示肝細胞受到嚴重損傷。

表2 3首解酒方對急性酒精中毒小鼠肝組織Caspase3/8活性 (±s)

表2 3首解酒方對急性酒精中毒小鼠肝組織Caspase3/8活性 (±s)

組別 動物/只 肝組織Caspase3活性/(U·mg pro－1) 肝組織Caspase8活性/(U·mg pro－1)13 1.26±0.27 0.81±0.21模型對照組 14 6.63±0.59＊＊＊ 2.67±0.32＊＊＊葛根散大劑量組 12 2.29±0.61ab＊＊＊△△△ 1.70±0.29#中劑量組 15 3.76±0.51### 1.63 ±0.31b＊＊＊△△△§§小劑量組 13 4.89±0.44### 1.69±0.31#石膏湯大劑量組 14 5.94±0.42#1.61 ±0.29b＊＊＊△△△§§中劑量組 13 5.89±0.40b＊＊＊a§§§ 1.99±0.24#小劑量組 13 6.07±0.52# 2.49±0.21###葛花解酲湯大劑量組 12 2.52±0.39b＊＊＊△△△§§§ 1.09±0.28ab＊△△△中劑量組 15 3.07±0.41# 1.27±0.36#小劑量組 13 4.44±0.45### 1.96±0.30正常對照組###

本實驗考察的3首解酒方劑中，葛根散解熱生津、健脾和胃，石膏湯解熱除煩、生津止渴，葛花解酲湯分消酒濕、溫中健脾，三方都主治飲酒過度、酒毒內蘊之證。現代研究表明，乙醇代謝產生的乙醛是使人喝酒后產生行為異常、惡心欲吐、昏迷不適等急性醉酒癥狀主要原因［6］;而酒精引起肝細胞破壞是導致酒精性慢性肝損害的關鍵始動因素。我們前期研究顯示，上述3方都具有明顯醒酒防醉作用，能明顯改善實驗小鼠昏睡、攀附力量降低、步態蹣跚、身子發抖等“醉酒”表現，其機制可能與其能夠明顯降低血乙醇水平和保護肝細胞的作用密切相關［3-5］。研究表明，反復肝細胞損傷是導致酒精性慢性肝損害的重要機制，而酒精引起肝細胞異常凋亡是其損害肝細胞的重要方面;中醫藥能有效醒酒防醉，治療飲酒過度、酒毒內蘊之證，同時對慢性酒精性肝病遠期療效較好［7-8］。因此，中藥防治慢性酒精性肝損傷是否與其緩解肝細胞凋亡、保護肝細胞有關，就成了研究解酒中藥遠期療效機制的核心內容之一。在我們考察3首解酒方保護肝細胞的機制時，發現它們可以明顯緩解肝細胞凋亡水平［5］。本實驗表2結果顯示，3首解酒方均能顯著降低模型小鼠肝組織Caspase3/8活性，提示3首復方具有抑制肝細胞凋亡的機制與其降低Caspase3/8活性有關。從3方不同劑量干預模型小鼠肝組織Caspase3/8活性能力的差異，提示其效應具有劑量依賴性。總之，本實驗初步觀察到葛根散等3首解酒方對急性酒精中毒小鼠肝組織Caspase3/8活性具有不同程度抑制作用，為深入研究各方解酒防醉、防治慢性酒精性肝病積累了一定的實驗依據。

［1］Green DR.Apoptotic pathways:the roads to ruin［J］.Cell，1998，94(6):695-698.

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［3］楊 柱，田維毅，王文佳.5首解酒方對小鼠醉酒模型解酒效應的比較研究［J］.中成藥，2010，32(11):1969-1972.

［4］楊 柱，田維毅，王文佳，等.葛根散等3首解酒方對乙醇致小鼠急性肝損傷的保護作用［J］.遼寧中醫藥大學學報，2010，12(4):7-9.

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