人參提取工藝的優化及其有效成分與藥效學相關性分析

王耀文， 孟憲生， 包永睿， 王 帥

(遼寧中醫藥大學，遼寧大連116600)

人參為五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根。具有大補元氣復脈固脫、補脾益肺、生津、安神之功效［1］。用于體虛欲脫、肢冷脈微、脾虛食少、肺虛喘咳、津傷口渴、內熱消渴、久病虛贏、驚悸失眠、陽痿宮冷、心力衰竭、心源性休克等［2］。人參皂苷大多具有增加白細胞數量、提高人體免疫力、促進物質代謝、抗疲勞、抗衰老等作用［3］。本研究設計正交實驗，以HPLC同時定量，優選出人參皂苷的提取條件，并以連二亞硫酸鈉為造模藥物，建立心肌細胞缺氧模型，以MTT測定心肌細胞存活率水平;考察所得優化工藝對心肌細胞的保護作用，確保療效，為人參臨床療效的發揮建立有效保障。

1 材料

1.1 儀器與藥材

Agilent1100-DAD液相色譜儀;CP225D電子分析天平(德國Sartorius，十萬分之一);微量移液器 (法國吉爾森科技有限公司);MiLLi-Q超純水處理裝置 (美國MiLLipore公司);AE31型倒置相差顯微鏡 (Motic公司);UNRISE酶標儀 (瑞士TECAN公司)。

人參藥材由大連市開發區陽光大藥房夠買，經遼寧中醫藥大學翟延君教授鑒定為 Panax ginseng C.A.Mey.;人參皂苷 Rb1、Re、Rg1(批號分別為 110704-200420、110754-200320、110703-200726，購自中國藥品生物制品檢定所)。

1.2 動物 新生SD乳鼠 (1～3d)，購自大連醫科大學實驗動物中心，達到國家清潔級標準，合格證號為SCXX(遼)-2008-0002。

2 方法與結果

2.1 正交實驗法優選人參提取工藝 選擇提取時間、提取次數、溶劑用量、溶液含醇量4個因素，對主要影響因素各取3個水平，進行L9(34)正交試驗考察，優選最佳提取條件［4-6］。每份取等量人參粉末，用乙醇回流提取，過濾，濾液減壓回收乙醇，減壓干燥得干膏。按下述方法分別制備樣品溶液并進行測定。

2.2 色譜條件與系統適用性試驗［7］Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為水 (A)-乙腈 (B)，二元線性梯度洗脫0～25 min:22%→23%B(78%A→77%A);25～28 min:22%B→ 30%B(77%A→70%A);28～60 min:30%B→34%B(70%A→66%A);60～80 min:34%B→40%B(66%A→60%A);80～90 min:40%B→50%B(60%A→50%A);90～100 min:50%B→60%B(50%A→40%A);體積流量1 mL/min;柱溫25℃;檢測波長203 nm;進樣量15 μL。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rb1對照品適量，加甲醇制成含 Rg10.218 mg/mL，Re 0.252 mg/mL，Rb10.366 mg/mL的混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備 精密吸取人參提取液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.5 細胞實驗處理

2.5.1 原代乳鼠心肌細胞的培養［8-9］取新生SD乳鼠若干只，無菌條件下開胸取心，用PBS液洗凈。并在適量冷PBS中將心室剪成碎塊放入培養皿里，用混合消化液多次消化，用培養液終止消化，離心，沉淀物加入培養液過200目篩，收集細胞懸液，以差速貼壁法分離純化心肌細胞，用培養液調整細胞濃度，轉接于96孔板里培養，獲得較純的心肌細胞，再繼續培養。選生長狀態佳者于72 h后進行實驗。

2.5.2 含藥血漿的獲得 將小鼠隨機分為10組，一組空白對照組，其余9組為正交試驗組。灌胃3 d，眼球取血，置Ep管中，離心，吸取上清液即為含藥血漿，經56℃30 min滅活處理后，用微孔濾膜過濾除菌，置－20℃保存備用。

2.5.3 分組 取接種完成的96孔板的心肌細胞隨機分為10組 (每組5孔細胞):①對照組:細胞板中加入Na2S2O437℃培養1 h，換入正常培養液復氧1 h后，培養24 h;②9組正交試驗組:含藥血漿 +Na2S2O4組，Na2S2O4培養1 h，正常DMEM/F12培養液復氧1 h后，加入含藥血漿37℃培養24 h。

2.5.4 MTT法測定心肌細胞活力［10］將心肌細胞接種于96孔板中，經上述實驗分組處理后，每孔避光加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL)，37℃繼續孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μLDMSO，振蕩10 min，使結晶物完全溶解。于波長492 nm處測各孔OD值，計算細胞活力，見表1［11］～2。

表1 人參正交試驗

表2 方差分析

以直觀分析表1及方差分析表2對實驗結果進行評價，結果表明，影響提取工藝的因素主次順序為B＞D＞C＞A，其中提取次數 (B)對藥材提取率影響最大，具有顯著性意義 (P＜0.05)。因此篩選確定提取條件為A2B3C2D3，即以8倍量80%乙醇回流提取3次，每次1 h。

2.6 正交驗證試驗 為了認證A2B3C2D3結果是否為最佳提取工藝，分別稱取3份等量人參，按照人參正交試驗中最佳提取工藝進行提取，其有效成分測定與藥效學試驗同上，結果見表3。經過藥效學與有效組分結合篩選出的結果與正交試驗得到的最佳提取工藝完全一致，因此本次試驗的最佳提取工藝結果為A2B3C2D3，且藥效學結果穩定。

表3 人參最佳提取工藝驗證結果

2.7 相關性分析 通過SPSS 17.0軟件將9組樣品的人參皂苷Rg1、Re、Rb1含有量分別與細胞存活率進行Pearson相關系數分析，結果見表4。

表4 相關性分析

人參皂苷Rg1、Re、Rb1含有量與存活率均呈正向直線相關，3種人參皂苷與存活率相關性為Rg1＞Rb1＞Re。

3 討論

3.1 中藥的有效成分復雜，在試驗過程中，由于人參的成分頗多，有皂苷類、有機酸類、脂類等成分構成，這些成分對總皂苷藥效的影響并不清楚，若單純以人參化學指標和總皂苷產率的高低來優選最佳提取工藝，已不能說明所提取成分藥效是否最佳。因此，本實驗采用將人參提取工藝與藥效雙重指標相結合的方法，使優選出的提取工藝更加有依據。驗證實驗表明，本實驗通過將活性成分和藥效相結合的方法使中藥提取產物突出其某方面療效，并反映出本研究的設計方法和技術路線是科學、合理、必要和可行的，為中藥提取工藝的優化提供了一種新的思路。

3.2 采用了正交試驗進行人參提取工藝的優選，正交設計具有“均勻分散，整齊可比”的特點，可減少試驗次數，避免眾多交互作用的解釋困難。與以往正交試驗單一的考察指標相比，本研究選擇多種活性成分作為指標，建立合理的關聯，并設不同權重系數來區分因素水平間差別，更好地達到了工藝優化的目的。驗證結果表明，這種設計方法是科學、合理、可行的。

3.3 本實驗直接應用Na2S2O4作用于原代心肌細胞，Na2S2O4作為一種氧清除劑，不僅不會損傷細胞膜，且一般在給予適當劑量下即可清除培養基中的氧，造成心肌細胞缺氧，可更好的建立心肌細胞缺氧/復氧模型，并通過MTT比色分析法測定活細胞數，其操作簡單，客觀準確，能反映細胞與藥物的關系，便于實驗室開展。

3.4 本實驗對人參中3種皂苷成分與心肌細胞存活率進行相關性分析，證明人參中3種皂苷成分是治療心肌缺氧的有效成分，以3種皂苷成分作為評價人參提取工藝的指標成分是合理的，并為以化學成分作為提取工藝的評價指標提供了理論依據。

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