膠原酶軟化CTO 中纖維瘢塊的實驗研究進展

強北平，Bradley Strauss

冠狀動脈慢性全梗阻(CTO) 是指梗阻3 個月以上，冠狀動脈造影TIMI 分級為0 或1 級的病變。CTO 病變極為常見，約占冠心病患者的30%左右［1］。臨床研究表明，CTO 的成功再通治療，能顯著改善患者心絞痛癥狀，左室功能，減低冠心病死亡率［2］。針對CTO 的介入再通治療，約占全部PCI (Percutaneous Coronary Intervention) 的8% ～15%，CTO 介入治療成功與否的關鍵是能否將導引鋼絲通過病變，達到CTO 的遠端。在過去的臨床及實驗研究中，幾乎所有的努力都集中在使用更為堅硬的導引鋼絲。但由于CTO 纖維瘢塊中存有大量的膠原纖維和鈣化，使纖維瘢塊極其堅硬，導引鋼絲往往極難通過，其介入治療成功率僅在60%左右［3］。這促使我們試圖尋找一種將CTO 中纖維瘢塊軟化，以利于導引鋼絲通過CTO 病變的方法。

膠原酶是基質金屬蛋白酶 (Matrix Metalloproteinase，MMP) 的一種，其主要作用是降解基質中的膠原纖維。CTO瘢塊的主要組成成分是膠原纖維，是導引鋼絲通過CTO 病變的主要障礙。本實驗室在過去的10 年中利用實驗性CTO 動物模型發現膠原酶能降解CTO 瘢塊中的膠原纖維軟化纖維瘢塊顯著性的改善導引鋼絲通過CTO 病變的成功率； 并對純化的臨床級別膠原酶進行了劑量和安全性實驗研究。為了進一步了解膠原酶對心肌的影響，向豬的正常冠狀動脈內注射不同劑量的膠原酶，發現在急性期(24h 內) 心肌組織有劑量依賴性的灶性出血； 低中劑量很安全，無心肌出血。膠原酶臨床一期劑量和安全性研究已經完成，膠原酶治療病例導引鋼絲通過病變的成功率為75%，患者臨床癥狀明顯緩解。進一步的臨床實踐和國際性合作正逐步展開。

利用實驗性CTO 動物模型進行了大量的實驗研究，試圖利用膠原酶軟化纖維瘢塊，促進CTO 的介入再通治療。本文在此對這些實驗研究予以綜述。

1 實驗性CTO 模型的病理特點

所有動物實驗都經多倫多大學附屬St Micheal's 醫院和Sunnybrook 醫院動物保護委員會同意。家兔股動脈CTO 模型制作如曾經報道過的方法［4］，將100U 牛血清凝血酶，注入兩端阻斷的約2cm 長的股動脈段內，靜置1h 以形成穩定的血栓。然后移去結扎線，飼養動物12 ～15 周后，病變演變為慢性全梗阻用于膠原酶的應用研究。臨床病理顯示人冠狀動脈CTO 內有大量的膠原纖維，尤其在CTO 近端，形成所謂“近端纖維帽”，此處是介入治療時導引鋼絲最難通過處，是介入再通治療的主要障礙之一［5］。組織病理學研究表明，家兔股動脈CTO 模型經歷了一個負性重塑過程。第2 周時，梗阻的血栓內形成了大量富含蛋白多糖的細胞外基質，基質成片狀沉積，隨后蛋白多糖含量隨時間逐漸減低，膠原纖維含量則逐漸增高。膠原纖維在第2 周時尚未出現，到第6 周時其含量達10%左右； 至18 周以后其含量已達15%。縱觀研究顯示，CTO 近端有致密的斑塊狀膠原沉積［6］，這些特點與人冠狀動脈CTO 極為相似(見圖1) 。

2 膠原酶

膠原酶的化學名為膠原蛋白水解酶(Collagenase) ，它能在生理pH 和溫度條件下特異性地切割膠原蛋白中甘氨酸殘基的氨基端鈦鍵，從而水解膠原蛋白的三維螺旋結構，而不損傷其他蛋白質和組織人體內部存在的膠原酶稱為內源性膠原酶，對于體內膠原蛋白的分解起著一定的作用。藥用膠原酶是從溶組織梭狀芽孢桿菌的發酵液中提取、純化并精制而得的白色或類白色無菌凍干粉針生物制劑，用于水解結締組織中的膠原成分，其藥動學特點是需要金屬鋅作為輔助因子參與酶解過程。膠原酶目前臨床主要用于Dupuytren 氏病。Dupuytren 氏病是一種手掌內膠原纖維病理性增生的疾病，膠原纖維的進行性增生形成掌心結節和病理性鍵索，造成關節攣縮，嚴重影響手掌功能。局部注射膠原酶，可降解手掌內異常增生的膠原纖維，松解指掌關節，改善手掌功能［7－8］。膠原酶在心血管疾病的應用尚未見其他報道。

3 膠原酶軟化CTO 內纖維瘢塊的實驗研究

3.1 實驗室級別膠原酶軟化CTO 內纖維瘢塊，促進導引鋼絲通過CTO 實驗研究 實驗室級別膠原酶(Collagenase Type1A，Sigma) 是從溶組織芽孢桿菌發酵而來，是包括膠原酶、非特異蛋白酶、梭菌蛋白酶、中性蛋白酶和氨基肽酶在內的多種酶的混合物。分子量在68 ～130KDa 為一般用途的膠原酶。將一直徑3.0mm 的Over－the－wire (OTW) 球囊導管在X 線導引下送至髂總動脈，用2 根常規0.014 的PTCA 導引鋼絲(Wizdom ［Cordis］和Choice PT ［Boston Scientific］) 分2 次試圖通過CTO。如鋼絲未通過CTO 且造影未發現血管撕裂，CTO 病變則被選入膠原酶應用研究。迅速將導管送至CTO 近端，將球囊打至4 個大氣壓，以形成1 個在球囊頂端和CTO 近端之間的封閉空間。移去鋼絲，沿OTW 導管將含Type1A 原酶(100μg 或450μg) 總量為1.5ml 的液體注入此空間。最初10例，我們在 膠原酶注入1h 后立即進行導引鋼絲穿過試驗，均已失敗告終?；谶@樣的經驗，以后的鋼絲通過試驗均在膠原酶注入72h 后進行?？偣?5 個CTO 病變，隨機行對照組(24例) 或膠原酶組(21 例) 試驗。一期試驗： 膠原酶100μg，n=14； 二期試驗： 膠原酶450μg，n =31。當血管造影顯示導引鋼絲成功穿過CTO 病變，或出現較大的血管撕裂或持續25min 仍不能通過病變，則終止介入手術。然后處死動物，取出股動脈標本，做HE 和MOVAT 染色，行組織病理分析。另有6 個CTO 病變在注射膠原酶(450μg) 后24h，取出標本行膠原酶活性和膠原片段生化分析。實驗結果表明，用藥72h后，膠原酶治療組導引鋼絲通過CTO 病變的成功率顯著高于對照組(62% VS 29%，P =0.028) ； 血管壁撕裂的發生率兩組并無顯著性差異。組織病理顯示導引鋼絲成功通過的CTO橫切面內瘢塊被破壞而且血液充溢開通的血管腔(見圖2) 。內彈力膜撕裂的比率，膠原酶治療組和對照組無顯著性差異(15 ±17%和20 ±24%，P=0.28) 。在450μg 膠原酶治療組可見皮膚表面輕度發紺。明膠酶譜顯示有明顯增多的92－和82－kDa 的裂解帶，表明僅在膠原酶治療組有MMP－9 酶前體及活性成分(見圖3A) ； 蛋白免疫印記分析表明膠原降解片段也明顯高于對照組(見圖3B) 。本實驗結果提示局部注射膠原酶，能在不破壞動脈深層結構的基礎上，有效的降解CTO 內纖維瘢塊的膠原成分，促進導引鋼絲通過CTO 病變［4］。

3.2 臨床級別膠原酶軟化CTO 纖維瘢塊的有效性和毒性研究 為了能將膠原酶在CTO 再通治療中的應用推向臨床，我們對一種臨床級別的膠原酶的有效性和毒性進行了臨床前研究。這種更為純化的膠原酶 (CorCordase，Advance Biofactures，Lynbrook，NY) 包括兩種成分，膠原酶ABC1 和膠原酶ABC2，均從溶組織芽孢桿菌分離純化而來，都是約含1 000 個氨基酸的多肽鏈，前者分子量為115KD，后者為110KD［9－10］，兩種成分之間無交叉免疫反應。這種純化的膠原酶對各種膠原纖維都有一定水解活性，其強度是實驗室級別膠原酶的38 倍，而且已經用于包括Dupuytren 氏病在內的臨床實踐。依上文所述同樣方法，局部注射150μg 純化膠原酶24h 后，導引鋼絲順利通過所有17 例CTO 病變，其中2 例出現血管撕裂。毒性研究表明，動物股部皮膚有劑量依賴性的發紺出現。注射50μg 時無發紺出現，150μg 時皮膚輕度發紺，500μg 時則有嚴重皮膚發紺。組織病理并未發現血管壁結構破壞。明膠酶譜顯示僅膠原酶治療組存在MMP－9 和MMP－2 酶前體及其活性成分；蛋白免疫印記分析表明膠原酶治療組較對照組有更高的MMP－1 蛋白和膠原降解成分［11］。

3.3 冠狀動脈內注射膠原酶后的安全性研究 為了進一步了解膠原酶冠狀動脈內注射后的安全性，我們向正常豬的冠狀動脈內注射膠原酶Type1A，以期了解膠原酶對心臟的毒性反應。在X 線引導下，將1 直徑2.0 ～2.5mm 的OTW 球囊導管沿0.014 導引鋼絲送至前降支第二對角支處，打開球囊至14 個大氣壓，冠狀動脈造影以確定冠狀動脈被完全阻斷，然后沿OTW 導管注入(50、100、250、400、600、800、1200、1600和3200μg) 的9ml PBS 液體。8min 后除去球囊導管，行冠狀動脈造影。分別于24h 或30d 后處死動物，取出心臟作病理切片，以觀察心肌出血，炎癥改變。冠狀動脈內注射膠原酶24h后，除球囊擴張對血管壁造成的炎性反應外，未見膠原酶對血管壁的破壞作用。對照組和低劑量治療組(600μg 以下) ，未見心肌有明顯變化。高劑量組(800 ～3600μg) ，心肌則有明顯的上皮出血，主要集中在右室和左室心尖。顯微鏡下，600～1200μg 組已出血輕度灶性出血，1600 ～3200μg 則出現中度出血。所有標本均有輕度的炎性細胞浸潤。到30d 時，心肌的出血現象已消失，代之以心內膜下心肌纖維化(見圖4) 。

3.4 膠原酶軟化CTO 內纖維瘢塊的臨床研究 經過近10 年不懈的實驗研究，膠原酶軟化CTO 纖維瘢塊的應用實踐終于于2009 年從實驗室走向臨床。一期膠原酶劑量安全性研究已經完成。共20 例患者，所有患者均經至少1 次的PCI 血管再通治療但均以失敗告終?；颊叻? 組，每組5 人； 所用純化的臨床級別膠原酶劑量分別為300μg、600μg、900μg 和1200μg。膠原酶經OTW 球囊導管或fine－cross 導管送至CTO 病變處，持續約30min。24h 后，患者回到導管室，行PCI 血管再通治療。膠原酶治療后導引鋼絲通過病變的成功率是75%。由于放支架時造成的側支缺血，有3 例出現了非ST 段抬高的心肌梗死。3 個月后CT 血管造影顯示無后續并發癥，膠原酶治療成功病例支架仍然開通； 心絞痛癥狀明顯緩解［12］。

CTO 病變目前是介入心臟病學需要攻克的主要障礙之一，應用膠原酶軟化CTO 纖維瘢塊的臨床研究以及多中心的國際合作正在逐步展開。也許在不遠的將來膠原酶對CTO 纖維瘢塊的軟化，就會成為CTO、PCI 血管再通治療的主要手段之一。

圖1 人冠狀動脈CTO 和家兔股動脈CTO 模型病理橫切面Figure 1 Pathological transverse coronary CTO and rabbit femoral artery CTO model

圖2 導引鋼絲成功通過CTO 橫切面的組織病理Figure 2 Tissue pathology of guide wire successfully passed the CTO transverse

圖3 膠原酶治療組與對照組的比較Figure 3 Comparison of collagenase treatment group and control group

圖4 冠狀動脈內注射膠原酶后的變化Figure 4 Change of intracoronary injection of collagenase

1 Stone GW，Kandzari DE，Mehran R，et al. Percutaneous recanalization of chronically occluded coronary arteries： a consensus document：part I ［J］. Circulation，2005，112 (15) ： 2364－2372.

2 Mehran R，Claessen BE，Godino C，et al. Long－term outcome of percutaneous coronary intervention for chronic total occlusions ［J］.JACC Cardiovasc Interv，2011，4 (9) ： 952－961.

3 Stone GW，Reifart NJ，Moussa I，et al. Percutaneous recanalization of chronically occluded coronary arteries： a consensus document： part Ⅱ［J］. Circulation，2005，112 (16) ： 2530－2537.

4 Strauss BH，Goldman L，Qiang B，et al. Collagenase plaque digestion for facilitating guide wire crossing in chronic total occlusions ［J］. Circulation，2003，108 (10) ： 1259－1262.

5 Srivatsa SS，Edwards WD，Boos CM，et al. Histologic correlates of angiographic chronic total coronary artery occlusions： influence of occlusion duration on neovascular channel patterns and intimal plaque composition ［J］. J Am Coll Cardiol 1997，29 (5) ： 955－963.

6 Jaffe R，Leung G，Munce NR，et al. Natural history of experimental arterial chronic total occlusions ［J］. J Am Coll Cardiol，2009，53(13) ： 1148－1158.

7 Hurst LC，Badalamente MA，Hentz VR，et al. Injectable collagenase clostridium histolyticum for Dupuytren's contracture ［J］. N Engl J Med，2009，361 (10) ： 968－979.

8 Desai SS，Hentz VR. Collagenase clostridium histolyticum for Dupuytren's contracture ［J］. Expert Opin Biol Ther，2010，10 (9) ：1395－1404.

9 Matsushita O，Jung CM，Katayama S，et al. Gene duplication and multiplicity of collagenases in Clostridium histolyticum ［J］. J Bacteriol，1999，181 (3) ： 923－933.

10 Yoshihara K，Matsushita O，Minami J，et al. Cloning and nucleotide sequence analysis of the colH gene from Clostridium histolyticum encoding a collagenase and a gelatinase ［J］. J Bacteriol 1994，176(21) ： 6489－6496.

11 Segev A，Nili N，Qiang B，et al. Human－grade purified collagenase for the treatment of experimental arterial chronic total occlusion［J］. Cardiovasc Revasc Med，2005，6 (2) ： 65－69.

12 Strauss BH，Osherov AB，Radhakrishnan S，et al. Collagenase Total Occlusion－1 (CTO－1) Trial： A Phase I，Dose－Escalation，Safety Study ［J］. Circulation，2012，125 (3) ： 522－528.