正交實驗法優選清肺平喘顆粒的提取工藝

李玉平，張 利，黎曉敏*

（1.西南大學動物科技學院，重慶 400715；2.重慶市獸藥工程技術研究中心，重慶 400716）

近年來，畜禽生產中越來越多的疾病都伴隨氣喘的癥狀，氣喘可引起畜禽的抵抗力下降，從而引發多種疾病，同時使生產性能下降，經濟效益降低，給養殖業造成重大經濟損失。為了減少化學藥物的藥物殘留，保障食品安全，應該加強對中獸藥制劑的研發和應用。目前，我國中獸藥制劑工藝比較落后，大多數成方制劑仍以散劑為主，有效成分不能合理應用。顆粒劑既能夠保持中醫藥的傳統用藥特色，又能最大限度地提取和保留處方中藥物的有效成分，發揮有效成分的綜合治療作用，確保臨床療效。同時，顆粒劑性質穩定，服用、攜帶、儲藏、運輸均較方便。

清肺平喘顆粒的方劑由板藍根、浙貝母、甘草、葶藶子、桔梗組成，具有清肺平喘，止咳化痰的功效[1]。為了發揮藥物的最佳療效，也便于生產中的臨床給藥，進而優化制備工藝。試驗對組方進行分析，根據各味藥材所含成分的性質，擬分水溶和醇溶兩組提取。本試驗以甘草酸和貝母素甲的含量及其所得浸膏率為考察指標，采用正交實驗設計，對各自提取工藝進行優化，選取最佳提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HH-S6數顯恒溫水浴鍋由金壇市醫療儀器廠生產，旋轉蒸發儀由德國海道夫公司生產，Waters高效液相色譜儀、蒸發光散射檢測器、紫外檢測器由美國Waters公司生產，KQ-600DA數控超聲波清洗器型由昆山市超生儀器有限公司生產。

1.2 試劑

貝母素甲、甘草酸銨標準品購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純；藥材均購自重慶市桐君閣大藥房，經鑒定均符合2010年版《中國獸藥典（一部）》規定。

2 試驗方法

2.1 醇提工藝條件的研究

2.1.1 正交實驗設計

根據浙貝母、葶藶子、桔梗所含成分的性質及參考有關文獻，確定乙醇用量（A）、提取時間（B）、乙醇濃度（C）、提取次數（D）4個因素，選擇3個水平進行試驗考察，采用正交設計試驗L9（34）表進行試驗，因素水平見表1。

表1 醇提法因素水平

2.1.2 提取方法

按照處方比例稱取浙貝母、葶藶子、桔梗藥材各9份，按正交表設計進行提取，合并提取液，過濾，60℃下旋轉濃縮至50 mL，作為貯備液。以貝母素甲的含量和出膏率作為指標進行直觀分析和方差分析，優化醇提工藝。

2.1.3 浸膏得率的測定

精密吸取提取液25 mL，置干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干后，105℃干燥3 h，取出，置干燥器內冷卻30 min，精密稱重，計算出膏率。

2.1.4 貝母素甲的含量測定

色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水-二乙胺（70∶30∶0.3）為流動相，蒸發光散射檢測器。理論板數按貝母素甲峰計算應≥2 000。蒸發光散射檢測器參數：漂移管溫度為85.5℃，載氣流速為2.2 L·min-1。流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30℃。

對照品溶液的制備：準確稱取貝母素甲對照品2.0 mg，甲醇溶解，定容至10 mL，得到濃度為0.2 mg·mL-1對照品溶液。

供試品溶液的制備：精密量取對照品溶液約5 mL，置燒瓶中，加濃氨溶液1 mL浸潤1 h，精密加入三氯甲烷-甲醇（4∶1）的混合溶液10 mL，稱重，混勻，置80℃水浴中加熱回流2 h，放冷，再稱重，加對照品溶液補足減失的重量，過濾。將續濾液置蒸發皿中蒸干（60℃），用甲醇定容至2 mL，搖勻，即得供試品溶液。

標準曲線的繪制：精密稱取貝母素甲對照品10.20 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即制成含貝母素甲1.02 mg·mL-1。分別吸取溶液0.2、0.4、0.8、1.6、3.0 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇配制成系列濃度溶液。精密吸取各溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積[2-4]。以峰面積的自然對數值為縱坐標，貝母素甲進樣量的自然對數值為橫坐標，作直線回歸，得回歸方程為：Y=1.3663X+8.1504，r=0.9996，結果表明，貝母素甲含量為0.204～3.06 μg，線性關系良好。

含量測定：精密吸取對照品溶液和樣品溶液各10 μL，按上述色譜條件，注入高效液相色譜儀，測定。

2.1.5 驗證試驗

取3份樣品，采用加醇量12倍、80%的乙醇濃度進行提取，時間為1.5 h，提取2次，測定貝母素甲的含量。

2.2 水提工藝條件的研究

2.2.1 正交實驗設計

將上述醇提取后的藥物殘渣和板藍根、甘草水煎提取，確定加水量（A）、提取時間（B）、提取次數（C）3個因素，選擇了3個水平進行試驗考察，采用正交設計試驗L9（34）表進行試驗，因素水平見表2。

圖1 貝母素甲對照品溶液HPLC結果

表2 水煎煮法因素水平

2.2.2 提取方法

按照處方比例稱取板藍根和甘草藥材共9份，按正交表設計進行提取，合并提取液，濾過，60℃下旋轉濃縮至50 mL，作為貯備液。以甘草酸含量和出膏率作為指標進行直觀分析，優化水提工藝。

2.2.3 浸膏得率的測定

精密吸取提取液25 mL，置干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干后，105℃干燥3 h，取出，置干燥器內冷卻30 min，精密稱重，計算出膏率。

2.2.4 甘草酸的含量測定

色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-0.2 mol·L-1醋酸銨溶液-冰醋酸（66∶33∶1）為流動相；檢測波長為250 nm。理論板數按甘草酸峰計算應≥2 000。

對照品溶液的制備：精密稱取甘草酸銨對照品約1.0 mg，置25 mL容量瓶中，流動相稀釋并定容至刻度，即得（每1 mL含甘草酸單銨鹽對照品40 μg，折合甘草酸為39.18 μg）。

供試品溶液的制備：精密量取貯備液約2 mL，置25 mL容量瓶中，加流動相至刻度，超聲處理（功率100 W，頻率20 kHz）60 min，取出，放冷，補足減失的重量，搖勻，過濾，取續濾液，即得備用。

標準曲線繪制：精密量取甘草酸銨適量，置25 mL的容量瓶中，用流動相稀釋并定容至刻度，配制濃度為80.0 μg·mL-1的對照品溶液。分別吸取貯備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于10 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，按上述色譜條件，分別依次進樣，進樣量10 μL，測定峰面積[5-7]。對峰面積（Y）對其濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程為Y=8538.4X－4395.7,r=0.99994。結果表明，甘草酸含量為7.84～78.36 μg·mL-1呈良好的線性關系。

含量測定：精密吸取對照品溶液和樣品溶液各10 μL，按上述色譜條件，注入高效液相色譜儀，測定。

圖2 甘草酸銨標準品HPLC結果

2.2.5 驗證試驗

取3份樣品，加水量10倍進行煎煮，時間為1.5 h，提取2次，測定甘草酸含量。

3 試驗結果

3.1 醇提法提取工藝結果

醇提法提取工藝結果見表3～5。

表3 醇提法提取工藝正交實驗

表4 醇提法浸膏得率方差分析

表5 醇提法貝母素甲含量方差分析

從正交實驗結果來看，對浸膏得率影響大小依次為D＞A＞B＞C，直觀分析結果表明最佳提取工藝為A3B2C1D3；對貝母素甲含量的影響主次順序為D＞C＞A＞B，直觀分析結果表明最佳提取工藝為A3B2C3D2;方差分析結果來看，提取次數對干膏得率和貝母素含量的影響顯著，加醇量和提取時間對浸膏得率有影響，提取濃度對含量影響顯著。從實際出發，綜合分析，選擇的最佳提取工藝為A3B1C3D2，即為加醇量12倍，提取1.5 h，乙醇濃度為80%，提取2次。

3.2 醇提取法驗證試驗

出膏率分別為14.5%、15.0%和14.2%，貝母素甲含量為 50.5、47.7、45.6 μg·mL-1，則進一步證明，該工藝穩定、可行，可作為最佳提取工藝。

3.3 水提法提取工藝結果

水提法提取工藝結果見表6～8。

表6 水提法正交實驗

表7 水提法浸膏得率方差分析

表8 水提法甘草酸含量方差分析

由表6～8可知，對浸膏得率影響順序為C＞B＞A，直觀分析結果表明最佳提取工藝為A1B3C3；3個因素中，提取次數對浸膏得率有顯著影響；對甘草酸含量的影響主次順序為C＞A＞B，3個因素對甘草酸含量影響都不顯著；直觀分析結果表明，最佳提取工藝為A2B2C3；從實際出發，綜合分析選擇的最佳提取工藝為A2B3C3，即加水量10倍，提取1.5 h，提取3次。

3.4 水提法驗證試驗

出膏率為26.40%、24.88%和26.24%，甘草酸含量為31.42、30.62和32.42 ug·mL-1。結果進一步證明，該工藝穩定、可行，可作為最佳提取工藝。

4 討論

中獸藥在治療哮喘方面有獨特的優勢，其具有作用靶點多、副作用小、療效確切等優點。目前，大多數中獸藥制劑多以散劑為主，制作粗糙，服用量大，不利于畜禽的吸收，而制成顆粒劑，使起主要作用的有效成分濃度增高，進而增強了其藥效；溶解釋放迅速、起效快，便于動物吸收；給藥途徑上，顆粒劑既可飲水，也可混飼，克服了中獸藥散劑必須通過混飼的方式給藥的缺陷；顆粒劑中添加了矯味劑，克服了某些中藥的苦味，口感好，動物服用方便；顆粒劑性質穩定，質量可控，適于工業化生產；制成顆粒劑后，體積重量遠比散劑小的多，服用、攜帶、儲藏、運輸均較方便。

清肺平喘顆粒為復方制劑，成分復雜。提取時需根據處方中各藥材多含有效成分的性質進行選擇。浙貝母主要有效成分是貝母素甲、貝母素乙等甾體生物堿，在乙醇中的溶解度大。而葶藶子主要含槲皮素、山奈酚等，為基本苷元的黃酮苷類成分，易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑。桔梗的主要活性成分桔梗皂苷也易溶于乙醇，同時有關研究表明，采用醇提法提取效率高，故采用乙醇回流提取[8-9]。甘草所含有效成分甘草酸、甘草次酸等水溶性強，有報道指出，將甘草和板藍根同以上藥渣共水煎煮進行提取可提高提取率[10-11]。

正交實驗中有效成分含量的選擇需根據藥材中止咳平喘藥效較強的主要活性成分以及藥典中含量測定方法的標準來確定，故選擇貝母素甲、甘草酸的含量作為評價的指標。但是復方中成分復雜，僅僅靠單指標評價有一定的局限性，故選擇出膏率和有效成分的含量共同作為評價指標，可綜合評價工藝的合理性。

5 結 論

本試驗結果表明，最佳醇提工藝為：濃度為80%乙醇、12倍的量，提取2次，每次提取1.5 h。最佳水提工藝為：加水量10倍，提取1.5 h，提取3次；經過驗證實驗，出膏率和含量均較高，穩定性好，工藝可行。

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