Bcl-2、CytC和caspase-3在實驗性精索靜脈曲張大鼠生精細胞中的表達及意義

成建軍 張雁鋼 李超鵬

1.山西醫科大學，山西 太原 030001；2.山西醫學科學院 山西大醫院，山西 太原 030001

精索靜脈曲張（varicocele，VC）即精索內蔓狀靜脈叢呈不同程度的擴張和迂曲，是青年男性泌尿科常見疾病，發病率約15%（8%～20%）。發病以左側為主，占70%以上，是引起男性不育的重要原因之一。目前對于VC導致不育的研究主要集中在睪丸局部缺氧、代謝產物返流等方面[1]。但VC導致男性不育的確切機制仍然存在較大爭議。本實驗通過探討Bcl-2、細胞色素C（CytC）和caspase-3在精索靜脈曲張大鼠生精細胞中的表達及三者與睪丸組織凋亡的關系，期望得到VC導致男性不育的凋亡機制。

1 材料與方法

1.1 模型的建立和分組

雄性Wistar大鼠72只，鼠齡為6周，體重115～135 g。72只雄性Wistar大鼠隨機分為6組，分別為A1組、A2組、A3組、B1組、B2組、B3組；A1組、A2組和 A3組為實驗組，B1組、B2組和B3組為對照組。選取36只大鼠建立ELV模型，36只行對照手術。模型建立方法：將左腎靜脈與0.55 mm的自制金屬桿一起結扎，造成左腎靜脈狹窄，可使左腎靜脈直徑縮小約一半，建立青春期大鼠實驗性左側精索靜脈曲張（experimental left varicocele，ELV）模型。對照組游離左腎靜脈，但不結扎。術后2、4、8周，分別取造模成功的大鼠（實驗組6只及對照組6只），并取左側睪丸。以精索靜脈直徑大于1 mm、左腎無萎縮為模型建立的標準。其中8周（A3）實驗組未達到實驗所需的動物模型數，造模成功5例；由A1及A2組剩余模型飼養達8周時隨機取1例補充。

1.2 標本采集

模型大鼠及對照組大鼠的左側睪丸組織，用福爾馬林液浸泡48 h，包埋蠟塊。

1.3 標本處理

1.3.1 HE染色 5μm厚度切片，脫蠟，蘇木素-伊紅（HE）染色后封片。

1.3.2 免疫組化 切片厚度5μm，采用SP法檢測，一抗、SP試劑盒和DAB顯色劑購自博奧森生物公司，操作嚴格按照說明書進行操作。細胞成分呈棕黃色為陽性表達。陰性對照步驟同實驗組，其中由PBS代替一抗。用顯微鏡觀察并拍照免疫組化切片，用BI-2000醫學圖像分析系統分析Bcl-2、CytC和caspase-3在大鼠睪丸組織中的表達，并測量陽性細胞平均灰度值。平均灰度值越低，免疫反應陽性越強。

1.3.3 TUNEL 切取5μm厚睪丸組織石蠟切片，實驗步驟嚴格按北京中山金橋公司提供的試劑盒說明書檢測細胞凋亡，細胞核染成棕色者為TUNEL陽性細胞，光鏡下（×400）每張切片選取10個視野，計數500個細胞，計算生精細胞中的凋亡細胞所占百分率，作為生精細胞的凋亡指數（AI）。

1.4 統計學方法

應用SPSS 17.0軟件包進行統計學處理，計量資料數據以均數±標準差（）表示，多組間的比較采用方差分析，兩兩間的比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色

對照組睪丸生精上皮完整，各級生精細胞及精子排列有序。ELV 2周組無明顯變化。ELV 4周組睪丸生精細胞上皮變薄，不完整，曲細精管管腔增大，精子明顯減少，各級生精細胞減少，并可見一些細胞的染色質邊集化，呈環狀。ELV 8周組生精上皮基膜破裂，一些曲細精管中出現“多核巨細胞”（multinucleated giant cells），即多個細胞核聚集形成一個大的細胞團塊，其中一些細胞核染色質明顯邊集化，呈環狀，間質細胞水腫增大。

2.2 免疫組化

Bcl-2、CytC和caspase-3蛋白在實驗組和對照組的各級生精細胞細胞質和細胞核中均可見到表達，陽性結果均為棕黃色物質分布。兩組的平均灰度值見表1。

表1 實驗組、對照組免疫組化平均灰度值（）

表1 實驗組、對照組免疫組化平均灰度值（）

注：與對照組相同時間段比較，◆P＜0.05；與本組2周時比較，▲P＜0.05；與本組4周時比較，★P＜0.05

組別 只數Bcl-2 CytC caspase-3實驗組2周4周8周對照組2周4周8周6 6 6 6 6 6 113.14±10.15 141.56±6.16◆▲152.28±4.97◆▲★161.02±8.74 149.86±3.97◆▲138.69±8.08◆▲★162.38±7.85 140.44±6.81◆▲129.04±6.66◆▲★113.06±5.12 114.96±12.20 110.81±4.79 163.56±6.34 161.30±3.41 159.38±2.57 168.75±8.00 170.68±6.87 171.47±7.17

2.3 TUNEL法檢測凋亡

對照組中可見少量細胞凋亡細胞，主要集中在次級精母細胞及分裂期的精子細胞。2周實驗組可見極少量生精細胞細胞凋亡；4周實驗組可見曲細精小管中各級生精細胞較對照組及2周實驗組凋亡增加；8周實驗組可見曲細精小管中各級生精細胞大量凋亡，管腔變薄，管腔中可見大量凋亡的分裂晚期的精子細胞。見表2。

表2 實驗組和對照組凋亡指數（%）

3 討論

細胞凋亡又叫程序性細胞死亡，是細胞在一系列內源性基因的調控下發生的自然或生理性死亡的過程。細胞凋亡過程是受基因的精確調控而完成的，其具體的過程機制尚不明確，Bcl-2是一種細胞膜蛋白，主要存在于線粒體膜、滑面內質網和核膜上[2]，高水平的Bcl-2蛋白有抑制細胞死亡等作用，是細胞凋亡調控機制中的一個關鍵蛋白[3]。Tanaka等[4]證實Bcl-2能抑制睪丸生精細胞的凋亡和分化。CytC是一個線粒體起源的細胞凋亡信號，Bcl-2可通過抑制CytC從線粒體的釋放入細胞質，而Bax、Bak可與Bcl-2結合，阻止其對CytC釋放孔道的抑制作用，從而促進CytC從線粒體釋放，引起凋亡[5]。CytC通過接頭分子使caspase（胱冬肽酶）分子募集并相互酶解活化，進而誘導細胞凋亡。caspase-3是介導細胞凋亡的關鍵效應酶，是凋亡執行的重要效應分子。正常情況下，caspase-3以酶原的形式存在于細胞質中，無活性，當細胞接受凋亡刺激時，其被激活，而誘導凋亡[6]。caspase-3是多種凋亡刺激信號傳遞的匯聚點，它的活化是細胞凋亡進入不可逆階段的標志[7]。

本實驗發現，ELV 2周時，實驗組及對照組生精細胞凋亡指數比較未見明顯差異，實驗組及對照組Bcl-2、CytC和caspase-3表達未見明顯變化。有實驗表明VC對睪丸的損害隨時間進展而累積[8]，此時實驗組與對照組凋亡指數無明顯差異可能是因為VC對睪丸損害的累積效應尚不足以誘導生精細胞凋亡增加，或者睪丸組織通過多種機制產生代償作用降低了VC對睪丸損害的累積效應使其不足以誘導生精細胞凋亡增加。ELV 4周時，實驗組生精細胞凋亡指數及CytC、caspase-3表達較對照組顯著升高，實驗組Bcl-2表達較對照組顯著降低。可見隨著睪丸損害的時間累積效應增加，睪丸組織失代償導致睪丸生精細胞Bcl-2、CytC和caspase-3表達顯著變化，最終導致生精細胞凋亡增加。ELV 8周時，實驗組生精細胞凋亡指數及CytC、caspase-3表達較ELV 4周組進一步顯著升高，實驗組Bcl-2表達較ELV 4周組進一步顯著下降。可見隨著睪丸損害時間累積效應的增加，對睪丸生精細胞Bcl-2、CytC和caspase-3表達的影響進一步增加、生精細胞損害較前進一步加重。有研究發現Bcl-2通過干擾CytC的釋放阻斷caspase蛋白酶的激活，從而抑制凋亡[5],孫寶華等[9]發現Bcl-2不僅通過抑制CytC等進而抑制caspase-3的活化，還參與抑制caspase-3的合成。本實驗中Bcl-2與CytC、caspase-3的表達隨時間累積變化趨勢相反，且變化存在同步性，與孫寶華等的研究發現一致。

本試驗中，ELV大鼠生精細胞Bcl-2表達隨時間顯著下降，CytC、caspase-3表達隨時間顯著升高，ELV大鼠生精細胞凋亡指數隨時間顯著增大；Bcl-2與CytC、caspase-3的表達變化呈現同步性且趨勢相反。可見，VC可通過多種機制影響Bcl-2表達，進而導致CytC、caspase-3的表達變化，使大鼠睪丸生精細胞凋亡增加進而影響大鼠的睪丸生精功能。

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