微小RNA在直腸癌組織中的表達及其臨床意義

伍尚標 陳 戎 全天一 李志發

廣州醫學院第三附屬醫院胃腸外科，廣東 廣州 510150

MicroRNA（minRNAs）又稱微小 RNA，是一類不具有蛋白質編碼功能的單鏈RNA，一般長度僅為25個核苷酸左右。近年來研究發現，MicroRNA在生物體中參與許多生理病理過程，并發揮著極其重要的作用。其參與的細胞分裂、分化及凋亡活動中與腫瘤的關系最為密切。

直腸癌作為消化道惡性腫瘤極為常見。據統計，近年來我國直腸癌患者明顯增多，發病率上升明顯，嚴重威脅人民身心健康。因此，早診斷、早治療對直腸癌患者的預后改善有著極其重要的意義。

以MicroRNA為主要研究方向的癌癥靶向治療及其腫瘤分子標記技術已經成為世界熱點課題，具有很廣泛的應用前景，但是MicroRNA在直腸癌誘發機制中的作用研究還處于起步階段[1-2]。隨著實時熒光定量PCR（Real-time PCR）技術的大量應用，為基因在腫瘤調控機制中的作用提供技術支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

我院2009年1月～2011年6月實施手術治療的直腸癌患者60例，其中，男37例，女23例，患者中位數年齡49歲，標本均通過病例檢驗為直腸癌。在術中分離直腸腫瘤組織和遠離腫瘤組織的正常直腸樣本，并即時采用液氮凍存。

1.2 試劑與儀器

RNAiso Plus （TaKaRa）， Premix Ex TaqVersion 2.0，（TaKaRa），RNA PCR Kit （AMV）Ver.3.0 （TaKaRa）， 伊文藍（Invitrogen），T4 多核苷酸激酶（Invitrogen），[r-32P]ATP（北京原子能研究所），7500 Fast熒光定量 PCR 儀（ABI）。

1.3 RNA提取

低溫環境下使用一次性RNase-free塑料器皿，對上述收集的我院60例直腸癌患者腫瘤組織和遠離腫瘤組織的正常直腸樣本標本研磨，應用Total RNA提取試劑RNAiso Plus經行總RNA提取。應用紫外分光光度計檢測RNA純度。OD260/OD280（R）值在 1.8～2.0 之間。

1.4 引物及探針的合成

根據Chen、Schmittgen等[3-4]所述設計并挑選部分前體miRNA設計PCR引物，并以miRNA-47和miRNA-152反向互補序列設計Northern blot探針（由美國Invitrogen公司合成）。

1.5 MicroRNA的反轉錄PCR

取 1 μL 總 RNA 進行 RT-PCR，20℃孵育 15 min，50℃反應30 min，95℃ 5 min得到cDNA。PCR反應條件，94℃預變性 5 min，90℃變性 30 s，55℃退火 30 s，70℃延伸 90 s，35個循環。

1.6 Northern印跡雜交

取20 μL總RNA與甲酰胺1∶1混合，進行尿素SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳完畢后進行轉膜，將轉好的膜與被[r-32P]ATP標記的探針雜交。內參選定為5S rRNA。

1.7 MicroRNA的實時熒光定量PCR

以制備好的cDNA為模板，熒光染料為伊文藍，設定ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀參數為：95℃預變性2 min，95℃ 10 s，60℃ 40 s，40 個循環。

1.8 PAM法分析

對MicroRNA在直腸癌組織及其癌旁正常組織中表達量進行分析，根據表達量變化對標本進行癌和非癌定性判斷。隨機選取直腸癌組織40例，確定判斷標準即直腸癌組織與癌旁正常組織中表達量比值低于0.66。對另外20例標本組織進行組內隨機編號，應用Real-time PCR方法檢測顯著表達差異的MicroRNA，然后進行20例標本組織中癌和非癌定性鑒定，即可進行判定。

1.9 統計學方法

所得數據使用SPSS 13.0統計軟件包進行Student檢驗，結果以均數±標準差（）表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MicroRNA的實時熒光定量PCR

以管家基因U6 RNA做內參，用△△Ct法對Real-time PCR結果分析。其中，△△Ct=Ct miRNA-Ct U6，每個MicroRNA相對表達量為2-（△△Ct）。直腸癌組織與癌旁正常組織中表達量比值低于0.66的MicroRNA有41種。見表1。

2.2 Northern印跡雜交

根據Real-time PCR結果，隨即選取miRNA-152進行Northern blot。miRNA-152 表達量降低（圖 1），與其 Real-time PCR結果吻合，可旁證實時熒光定量PCR結果準確可信。

2.3 PAM分析

根據60例直腸癌標本篩選出的具有與癌旁正常結腸組織顯著表達差異的MicroRNA，對另外20例組內隨即編號的直腸癌組織與其正常直腸組織進行定性判斷，即組內樣品中MicroRNA表達量顯著降低的標本即可判定為直腸癌組織。其結果與病理檢驗完全一致，吻合率為100%。

3 討論

直腸癌是發達國家常見的惡性腫瘤之一[5]，近年來我國經濟發展，人民生活水平不斷提高，伴隨而來的卻是直腸癌發病率年增長速度的居高不下，年增率已接近4%，2倍于世界平均水平。直腸腫瘤通常是由直腸黏膜病變，而逐漸演變為腺瘤狀息肉，最后形成惡性腫瘤，瘤的形成較慢。如果在發病初期進行干預治療，直腸癌患者可達90%的存活率，但是，早期直腸癌患者并無顯著癥狀，有40%以上的患者屬于中晚期，預后較差，存活率大大降低。因此，直腸癌發生分子機制的研究對于早期診斷治療具有重大的臨床應用價值。

表1 60例直腸癌組織（T）及其癌旁正常結腸組織（N）中miRNA的比較（）

表1 60例直腸癌組織（T）及其癌旁正常結腸組織（N）中miRNA的比較（）

名稱 T/N 名稱 T/N 名稱 T/N 名稱 T/N miRNA-1 miRNA-7 miRNA-23a miRNA-23b miRNA-30a miRNA-30b miRNA-30d miRNA-32 miRNA-100 miRNA-125a miRNA-125b 0.19±0.04 0.42±0.04 0.23±0.09 0.46±0.08 0.36±0.05 0.54±0.05 0.52±0.11 0.48±0.13 0.46±0.10 0.46±0.06 0.39±0.07 miRNA-126 miRNA-130a miRNA-130b miRNA-133a miRNA-133b miRNA-136 miRNA-139 miRNA-143 miRNA-144 miRNA-145 miRNA-149 0.08±0.11 0.27±0.10 0.30±0.05 0.51±0.05 0.57±0.04 0.38±0.06 0.34±0.10 0.35±0.12 0.44±0.08 0.49±0.10 0.21±0.03 miRNA-150 miRNA-152 miRNA-181 miRNA-192 miRNA-193a miRNA-193b miRNA-194 miRNA-195 miRNA-196b miRNA-204 miRNA-212 0.22±0.11 0.30±0.08 0.48±0.05 0.52±0.06 0.19±0.04 0.39±0.08 0.17±0.12 0.28±0.13 0.22±0.06 0.10±0.05 0.36±0.05 miRNA-214 miRNA-215 miRNA-221 let-7a let-7b let-7c let-7e let-7g 0.36±0.09 0.33±0.08 0.47±0.10 0.24±0.12 0.39±0.06 0.31±0.08 0.30±0.05 0.29±0.10

圖1 直腸癌與癌旁正常組織miRNA-152表達變化（Northern blot）

最近對MicroRNA的研究已經成為腫瘤學研究的熱點。研究表明，腫瘤發生或個體的腫瘤易感性都與MicroRNA擴增和變異有相關性。很多MicroRNA的調控靶位點與抑癌基因偶聯，若這類MicroRNA功能紊亂則可導致下游基因表達的改變，進而可能會引發腫瘤的形成。據研究，有占50%以上的MicroRNA位于癌相關基因序列中，其隨著癌基因的表達而發生明顯變化[6-7]。因此，研究關鍵MicroRNA在腫瘤發生過程中的網絡調控機制和鑒定，可以作為腫瘤研究新的標記分子，開創腫瘤分子診斷學和癌癥臨床治療學的進新時代。

本實驗對60例直腸癌標本的MicroRNA進行實時熒光定量PCR檢測，發現其中有41種MicroRNA的表達量顯著下降，并用Northern印跡雜交進行驗證，結果一致。經PAM分析MicroRNA作為直腸癌檢驗依據結果可靠，方法可行。MicroRNA作為新的直腸癌標志物，具有靈敏度高、檢驗成本低等優點，可用于直腸癌早期篩查和普查。同時，由于能作為檢驗的MicroRNA種類多，所以能夠避免個體差異而產生的檢驗錯誤。

綜上，作為直腸癌的早期診斷和細胞靶向治療，對MicroRNA檢測都有臨床價值。但是MicroRNA在腫瘤中的作用機制還未完全明確，在臨床應用方面還未深入進行[8-9]。相信隨著生物醫學技術的不段進步，在直腸癌的早期有效診治方面MicroRNA將發揮極其重要的作用。

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