氯化兩面針堿對人肝癌裸鼠移植瘤基因表達譜的影響

劉麗敏，劉華鋼

(廣西醫科大學藥學院，廣西南寧 530021)

氯化兩面針堿(nitidine chloride，NC)是從廣西特有藥用植物兩面針［Zanthoxylum nitidum(Roxb)DC］的根中分離到的具有抗腫瘤活性的生物堿，本課題組前期的研究結果表明NC能抑制多種腫瘤細胞的生長，給藥劑量為10 mg·kg－1時NC對人肝癌HepG2裸小鼠移植瘤的抑瘤率為60.91%，與環磷酰胺療效相近［1－2］，具有較強的體內外抗腫瘤活性。為了進一步揭示其抗腫瘤機制，我們利用基因芯片研究了NC治療肝癌后一些相關基因表達的改變，了解NC在基因調控網絡中的影響，以期篩選NC的相關作用靶點，更全面探討NC針對肝癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 NC由廣西中醫藥研究院賴茂祥研究員分離提純(純度＞95%)，Human OneArray表達譜芯片由上海康成生物工程有限公司提供(Phalanx array);TRIzol試劑、Super ScriptryⅡRNase逆轉錄酶、dNTP:美國Invitrogen;cDNA標記試劑盒、NucAway柱:Ambion公司;單熒光標記CyDye:Amersham;EB:Sigma公司;DEPC:Amresco公司;瓊脂糖:加拿大BBI公司;RNA later:華氏生物技術有限公司;氯仿、異丙醇、無水乙醇:廣州新港公司;cDNA合成試劑盒、SYBR Green qPCR Kit:TaKaRa;PCR擴增引物為TaKaRa公司產品。

1.2 基因芯片檢測

1.2.1 標本處理 基因芯片分析所用的腫瘤組織樣品為本課題組前期建立的肝癌HepG2裸小鼠移植瘤模型［1］，NC 2.5、5 和 10 mg·kg－1劑量對肝癌HepG2的抑制率分別為 12.06%、35.63%和60.91%［1］。生理鹽水組和NC高劑量組各取瘤塊，生理鹽水沖洗。切至厚度在0.5 cm以下，長約1 cm，放入裝有5倍體積RNA later的凍存管中。4℃孵育過夜，然后轉入－20℃中保存待用。

1.2.2 總RNA樣品制備及雙鏈cDNA合成 TRIzol法抽提肝癌組織標本總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測總RNA質量、樣品濃度及總量，獲得的RNA溶液保存于－80℃。以純化后的RNA為模板，根據cDNA合成試劑盒的操作手冊合成cDNA的第1鏈和第2鏈。

1.2.3 aRNA合成、純化及標記 按照試劑盒說明操作，標記好的aRNA被收集在1.5 ml離心管中。未標記的染料留在柱子中。去掉柱子，測OD值，確定標記效率。使用NanoDrop ND-1000測定標記后aRNA的濃度以及純度，其中OD260/280值應該在1.8～2.1之間。標記上CyDye的aRNA的濃度比上總的aRNA的濃度即為aRNA標記效率，標記效率＞9，標記效率合格。

1.2.4 芯片雜交及檢測 雜交好的芯片干燥后經GenePix 4000B掃描儀掃描，軟件Imagequant 5.0將圖像轉化為基于熒光強度的數字信號顯示。將圖像導入圖像分析軟件OneArray GenePix Array List，自動尋點，手工微調。掃描儀自動開始分析，以陰性對照點雜交信號為參照，大于陰性對照點平均信號強度加上3倍的陰性對照標準偏差［＞Average(blank)+3SD(blank)］的雜交信號作為有效雜交信號。數據導入分析軟件，Ratio值通過LOWESS方法歸一化，表示每個基因點的雜交信號強度比值，或者是基因表達量在實驗組和對照組間的變化倍數(大于1代表相應基因表達量上調倍數，小于1代表相應基因表達量下調，其倍數用1除以該數值表示)。判斷標準Ratio大于1.5或小于0.67作為有效表達變化的基因數據。將分析結果導入Excel表，進行下一步分析，包括數據的預處理和歸一化、差異表達基因分析、芯片數據的統計學分析、聚類分析等。

1.2.5 實時熒光定量PCR驗證 采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)技術對部分差異基因(3個下調基因、1個上調基因)的表達水平進行了驗證。

1.2.5.1 總RNA樣品制備及雙鏈cDNA合成 同“1.2.2”。生理鹽水組和NC高劑量組各取6個樣本。

1.2.5.2 引物的設計和合成 參照文獻并從Gene Bank查找 TOP1、TOP2、IL-8、RTEL 及內參 GAPDH基因的全序列，再根據熒光定量PCR引物設計的基本原則，用Primer 5.0軟件設計，引物由TaKaRa公司合成。引物序列如Tab 1所示。

Tab 1 Real-time PCR primer sequence

1.2.5.3 Real-time PCR擴增及結果計算 建立一個25 μl的反應體系，2 ×SYBR Premix Ex TagTM12.5 μl，上下游引物各 0.5 μl，cDNA 溶液 2 μl，ddH2O 4.5 μl，優化的PCR反應條件為:95℃預變性5 min，再 95℃ 變性 10 s，59℃ 退火 15 s，72℃ 延伸(收集熒光)20 s。為了建立PCR產物的熔解曲線，擴增反應結束后繼續從72℃緩慢加熱到95℃(每0.5℃讀板一次)。各樣品目的基因和管家基因的濃度結果直接由儀器生成。每個樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對含量。

2 結果

2.1 基因表達改變的總體分析 數據分析顯示:在所檢測的30 968個基因中，NC處理組與生理鹽水組比較，發現有差異表達基因共有369個，其中上調基因183個，下調基因186個。我們在對這些表達差異基因進行分類時發現許多基因具有多種功能，參與多種細胞活動過程，涉及到細胞因子和生長因子受體和核受體、細胞凋亡、分化、細胞周期/周期素、蛋白降解、DNA損傷/修復、離子通道、信號傳導、轉錄/轉錄因子、細胞粘連等多個方面。差異基因影響的信號通路主要有泛素介導的蛋白質水解、細胞核受體、轉化生長因子及其受體信號通路、IL-3信號通路、細胞周期信號通路、鈣離子信號通路等。

2.2 部分表達差異的基因 我們從差異表達基因最多的細胞增殖與凋亡調控、細胞周期、腫瘤免疫相關等幾個方面篩選出部分基因，并對其功能進行簡單分析。由于篇幅所限，本文中僅列出部分與凋亡及細胞周期調控相關的基因，見Tab 2。

2.3 Real time PCR驗證部分差異表達基因的表達水平 采用GAPDH內參校正后樣品相對含量見Fig 3，其中3個基因的表達水平均低于對照組，一個基因的表達水平高于對照組，表達的改變與芯片研究結果具有一致性。

3 討論

肝癌的發生是一個復雜的過程，其表達譜與正常肝細胞相比有很大差別，其中表達增加的基因數目少于表達降低的基因數目，推測與癌細胞的功能簡單化有關，核糖體相關蛋白表達的降低也證明這一點［3－4］。我們在對NC作用后的差異表達基因進行聚類分析時發現有許多基因具有多種功能，參與多種細胞活動過程，涉及到細胞凋亡或腫瘤相關、結合蛋白相關及信號傳導、轉錄、翻譯等多個方面。結合基因表達狀態與功能分析，發現以下一些較為明顯的現象。

NC作用后Bcl-2家族的Bcl-w基因表達下調，Bcl-w這個基因在人和鼠是高度保守的，類似Bcl-2和Bcl-x，Bcl-w參與調控許多種細胞的凋亡，促進細胞存活，也是一個原癌基因［5］。研究者使用免疫組織化學法分析61例肺腺癌病例，顯示Bcl-w過表達與腫瘤分期、分化程度相關，并傾向于伴隨預后不良。用小分子RNA干擾技術下調Bcl-w表達明顯地抑制HUT29細胞的生長，但對抗癌藥物引起的細胞死亡無效。Bcl-w的過表達促進非小細胞肺癌尤其是肺腺癌的生長，可能是一個治療的靶點［6］。Bcl-w還是肝特異性的小分子RNA(miRNA)——miR-122的直接作用靶點，對肝細胞癌株Hep3B和HepG2，miR-122通過直接的靶向結合Bcl-w的3'-UTR區，調節Bcl-w的表達，使胞內的 Bcl-wmRNA和蛋白水平被抑制，并引起細胞存活率下降和caspase-3激活［7］。Bcl-2蛋白家族調節細胞凋亡的機制與線粒體密切相關。Bcl-2和Bcl-X1抑制細胞凋亡的部分原因是阻斷了細胞色素C(Cyto C)從線粒體釋放，Cyto C是凋亡蛋白酶激活的關鍵因素。Bcl-2可以直接或間接阻止Cyto C釋放，但不是唯一功能［8］。目前Bcl-w抑制細胞凋亡的具體機制是否也與線粒體有關尚未清楚。NC抑制Bcl-w基因的表達，促進腫瘤細胞凋亡，可能有利于提高腫瘤細胞對藥物的敏感性。

Tab 2 Differentially expressed genes in HepG2 cells after treatment of NC

Tab 3 Relative amount of mRNA in tumor organization treated by NC(±s，n=6)

Tab 3 Relative amount of mRNA in tumor organization treated by NC(±s，n=6)

group RTEL1/GAPDH TopoⅠ/GAPDH TopoⅡ/GAPDH IL-8/GAPDH Control 1.68E-01 2.36E-01 1.56E-01 6.60E-03 NC 1.02E-01 7.31E-02 1.30E-01 1.08E-02

其他與細胞凋亡調控和功能相關基因(如IHPK2、AMID、RTEL1)也有不同程度的變化，其中上調的基因IHPK2(inositol hexaphosphate kinase 2)即六磷酸肌醇酯激酶2，又名PiUS;IP6K2，該基因編碼的蛋白屬于肌醇磷酸激酶(IPK)家族，1998年被克隆出來，定位于人染色體的3p 21.3，認為它可能是細胞磷(體內)平衡的重要調節器［9］。Morrison等［10］為了研究干擾素IFN-β誘導凋亡的機制，采用反義技術敲除基因來辨別引起細胞死亡的基因產物，并分離了幾個干擾素-誘導死亡的調節子(RIDs)，其中一個是IP6K2，并鑒定了IP6K2是一個凋亡的正調節蛋白，IP6K2的過表達強化了 IFN-β和細胞毒劑對卵巢癌細胞的誘導凋亡作用。IP6K2的表達致敏腫瘤細胞，未受照射的NIH-OVCAR-3細胞轉染了IP6K2后形成克隆減少。IP6K2的過表達引起放射敏感性增加，表現為集落生成單位(CFU)減少。IFN-β和輻射都能誘生caspase-8，在IP6K2表達的細胞，Caspase-8 mRNA的誘導更明顯，資料顯示IP6K2的過表達強化了卵巢癌對放射和IFN-β的敏感性，IP6K2可能有利于增強細胞受損后caspase-8和死亡受體DR4的表達和(或)功能，IFN-β和γ輻照誘導凋亡，通過外部的、受體介導的的途徑，這兩個死亡誘導物都受 IP6K2的正調節［11］。此后Morrison等又進一步研究了IHPK2生長抑制和增強凋亡的機制，證實了IHPK2與TNF受體-伴隨的因子(TRAF)2結合及干擾了轉化生長因子β-活性激酶1(TAK1)的磷酸化，藉此抑制NF-κB信號。IHPK2包含2個與TRAF2結合的必需位點:Ser-347和Ser-359。與野生型IHPK2轉染的細胞相比，表達S347A和S359A突變的細胞在IFN-α作用后顯示出3到5倍的TAK1激活作用，這個突變體在IFN-α作用后，與野生型 IHPK2-表達的細胞相比，在NF-κBDNA結合方面表現出6到10倍的增強，而野生型IHPK2-表達的細胞NF-κB的DNA結合是被抑制的［12］。研究者認為IHPK2-TRAF 2結合引起TAK1和NF-κB介導的信號的衰減，可能是IHPK2細胞凋亡活性的部分原因。NC作用后IHPK2表達上調，有利于增強細胞凋亡。

在以前的研究中我們已證實，NC可能作用于細胞的G2/M調控點，表現出G2/M期阻滯作用，從而影響細胞的分裂增殖。NC可能會通過作用于G2/M期調控因子cyclinB1和cdc2，影響其mRNA水平及其蛋白表達［13］。基因芯片的結果發現NC作用后HepG2細胞的PR48、MTSS1基因表達上調，cyclin T2基因表達下調，其可能主要在細胞周期調控和DNA修復起作用。cyclin T2屬于高度保守的細胞周期素家族(cyclin family)，主要參與調節基因的轉錄。cyclin T2與周期素依賴激酶9(CDK9)結合形成 CDK9/cyclin T2復合物［14］，這個復合物是人類基因轉錄延伸因子P-TEFb的亞單位，它能磷酸化RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)最大亞基的羧基端結構域，激活PolⅡ的轉錄功能，抑制CDK9/cyclin T2的激酶活性，對PolⅡ催化的基因轉錄起負調控作用，其中包括HIV-1tat啟動子控制的基因轉錄反應［15-16］及基因轉錄偶聯修復功能，后者是指DNA修復效率與基因轉錄狀態有關，處于轉錄活躍狀態的基因的DNA損傷修復比沉默基因的修復效率要高，基因轉錄鏈的修復效率比非轉錄鏈的要高，這種修復反應是由有關DNA修復蛋白和某些轉錄因子共同完成。當細胞DNA受到損傷時，如果DNA損傷得到修復后細胞周期進程重新繼續。另一種修復損傷細胞的發生機制就是通過凋亡過程消滅它們。cyclin T2基因表達的下調，說明NC可能通過抑制cyclin T2介導的DNA轉錄、偶聯修復功能，導致細胞周期阻滯。

MTSS1基因又名MIM(Missing in metastasis)，是控制細胞生長和發展的重要調節因子，對細胞周期的發展起負調控作用。MTSS1的過表達抑制細胞增殖，其表達受其啟動子區內CpG島DNA甲基化的調節，但MTSS1的表達水平與p53的功能狀態無關［17－19］。Ma 等［20］研究了 MTSS1 在肝臟腫瘤發展中的作用，發現在肝細胞癌臨床患者中，MTSS1的基因和蛋白表達水平上升。它的表達明顯與早期病理學國際惡性腫瘤標記符號階段分組、腫瘤包裹、缺乏靜脈浸潤相關。發現更高的MTSS1表達與疾病的早期階段相關，MTSS1的表達可能影響肝細胞癌的發展并可能是疾病早期階段的一個有力標志。

除此之外，NC作用后與分裂/增殖相關的基因MIG6、TBCE表達明顯上調，而另一類與生長因子相關的基因如GRB7、CDH2、LAMA1等表達下調，提示NC可能通過某些機制抑制有絲分裂從而影響腫瘤細胞增殖。腫瘤免疫相關的基因CCL5、IL-8上調，IL-15、IFNE1、COX4I1下調。此類誘生的細胞因子可能通過誘導NK細胞增殖，增強NK細胞的活性，誘導LAKC和腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)，并刺激他們產生細胞因子，發揮廣譜的腫瘤殺傷活性。腫瘤免疫相關的基因可能在NC對癌細胞的生長調節中也發揮著重要作用。

綜上所述，NC作用于肝癌的基因調控是一個多基因、多環節、多途徑參與的過程。上述基因的改變為闡明NC誘導腫瘤細胞凋亡、細胞G2/M期周期阻滯的機制提供了很好的理論依據。但由于基因芯片上的基因是已知，而很多基因的功能目前尚未研究清楚，還受到基因表達與調控滯后的影響，如何解釋這些基因同時變化還有相當大的難度;并且基因表達不能完全代表其產物的功能，基因表達的結果是產生相應的蛋白質和酶，才能實現其各項生理功能，而基因與蛋白質功能并非完全平行。因此基因芯片的檢測只是第一步，只是提供了進行藥物作用機制全面分析的一個初步信息，對于已經初步獲得的差異基因，需做進一步分析驗證，還需要與其他檢測蛋白質和酶的實驗方法相結合，以充分發揮基因芯片高通量的優勢。

［1］ 劉麗敏，劉華鋼.氯化兩面針堿的抗肝癌活性及對DNA拓撲異構酶的影響［J］，中國藥理學通報，2010，26(4):497 －500.

［1］ Liu L M，Liu H G.Anti-hepatoma activity of Nitidine Chloride and its effect on topoisomerase［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(4):497－500.

［2］ 劉麗敏，劉華鋼，羅 丹，等.氯化兩面針堿體內和體外的抗腫瘤作用［J］.中國藥理學與毒理學雜志，2009，23(3):214 －8.

［2］ Liu L M，Liu H G，Luo D.Antitumor effect of nitidine chloride in vitro and in vivo［J］.Chin J Pharm acol Toxicol，2009，23(3):214－8.

［3］ 宮衛東，陽 威，李亞洲，等.原發性肝癌患者外周血中肝癌相關基因基因芯片篩查［J］.西南國防醫藥，2010，20(4):362－4.

［3］ Gong W D，Yang W，Li Y Z，et al.Screening hepatoma assoc iated genes in peripheral blood in patients with primary hepaticcarcinoma by gene chips［J］.Med J Nat Defend Forces Southwest China，2010，20(4):362－4.

［4］ 簡志祥，鄭江華，孫 建，等.利用基因芯片技術篩選肝癌早期復發相關基因［J］.實用醫學雜志，2010，26(24):4461 －5.

［4］ Jian Z X，Zheng J H，Sun J，et al.Identification of differentiated expression genes associated with early recurrence for hepatocellular carcinoma using genechip technology［J］ J Pract Med，2010，26(24):4461－5.

［5］ Navarro S J，Trinh T，Lucas C A，et al.The C57BL/6J mouse strain background modifies the effect of a mutation in Bcl2/2［J］.G3(Bethesda)，2012，2(1):99－102.

［6］ Kawasaki T，Yokoi S，Tsuda H，et al.BCL2L2 is a probable target for novel 14q11.2 amplification detectedin a non-small cell lung cancer cell line［J］.Cancer Sci，2007，98(7):1070 － 7.

［7］ Lin C J，Gong H Y，Tseng H C，et al.miR-122 targets an antiapoptotic gene，Bcl-w，in human hepatocellular carcinoma cell lines［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008 ，375(3):315 －20.

［8］ Bae I H，Yoon S H，Lee S B，et al.Signaling components involved in Bcl-w induced migration of gastric cancer cells［J］.Cancer Lett，2009，277(1):22 －8.

［9］ David S，Shames，John D，et al.IP6K2 is a client for HSP90 and a target for cancer therapeutics development［J］.PNAS，2008，105:1389－90.

［10］ Morrison B H，Bauer J A，Kalvakolanu D V，et al.Inositol hexakisphosphate kinase 2 mediates growth suppressive and apoptotic effects of interferon-beta in ovarian carcinoma cells［J］.J Biol Chem.2001，276(27):24965－70.

［11］ Morrison B H，Bauer J A，Hu J，et al.Inositol hexakisphosphate kinase 2 sensitizes ovarian carcinoma cells to multiple cancer therapeutics［J］.Oncogene，2002，21(12):1882 － 9.

［12］ Morrison B H，Bauer J A，Lupica J A，et al.Effect of inositol hexakisphosphate kinase 2 on transforming growth factor beta-activated kinase 1 and NF-kappaB activation.［J］.J Biol Chem，2007，282(21):15349－56.

［13］ 李丹妮，劉華鋼，劉麗敏，等.氯化兩面針堿誘導人肝癌細胞SMMC-7721凋亡的研究［J］.西安交通大學學報(醫學版)，2009，30(1):40 －3.

［13］ Li D N，Liu H G ，Liu L M，et al.Nitidine chloride-induced apoptosis of human hepatoma cell SMMC-7721［J］.J Xi an Jiaotong Univ(Med Sci)，2009，30(1):40－3.

［14］Kurosu T，Zhang F，Peterlin B M.Transcriptional activity and substrate recognition of cyclin T2 from P-TEFb［J］.Gene，2004，343(1):173－9.

［15］ Michels A A，Fraldi A，Li Q，et al.Binding of the 7SK snRNA turns the HEXIM1 protein into a P-TEFb(CDK9/cyclin T)inhibitor［J］.EMBO J，2004，23(13):2608 －19.

［16］ Parent M，Yung T M，Rancourt A，et al.Poly(ADP-ribose)polymerase-1 is a negative regulator of HIV-1 transcription through competitive binding to TAR RNA with Tat.Positive transcription elongation factor b(p-TEFb)complex［J］.J Biol Chem，2005，280(1):448－57.

［17］ Saarikangas J，Mattila P K，Varjosalo M，et al.Missing-in-metastasis MIM/MTSS1 promotes actin assembly at intercellular junctions and is required for integrity of kidney epithelia ［J］.J Cell Sci，2011，124:1245 －55.

［18］ Du P，Ye L，Ruge F，et al.Metastasis suppressor-1，MTSS1，acts as a putative tumour suppressor in human bladder cancer［J］.Anticancer Res，2011;31:3205 －12.

［19］ Liu W，Komiya Y，Mezzacappa C，et al.MIM regulates vertebrate neural tube closure［J］.Development，2011，138:2035 －47.

［20］ Ma S，Guan X Y，Lee T K，et al.Clinicopathological significance of missing in metastasis B expression in hepatocellular carcinoma［J］.Hum Pathol，2007，38(8):1201 －6.