硫化氫對急性缺血所致心肌細胞凋亡的影響

張建新，丁艷艷，李蘭芳，劉 芳，張勤增，解麗君，郝 娜

(河北省醫學科學院，河北 石家莊 050021)

研究顯示，急性心肌缺血和心肌梗死等心血管疾病有細胞凋亡現象存在［1］。細胞凋亡是按細胞的固有基因程序進行的一種生理現象，不同于一般病理情況下的細胞死亡，是機體為維護內環境的穩定，通過基因調控和酶促反應進行的細胞程序化死亡。近些年來研究發現，硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)在機體內發揮著廣泛的生物學效應，本研究室前期實驗表明，大鼠在急性心肌缺血過程中內源性H2S的含量明顯下降，心肌組織CSE活性明顯降低，線粒體功能受損，給予H2S可明顯減輕心肌缺血損傷，改善心功能和線粒體功能，從而有效保護缺血的心肌［2－3］。但是其對缺血心肌細胞凋亡的影響尚未見報道。本實驗觀察了H2S供體—硫氫化鈉(NaHS)對大鼠急性心肌缺血后心肌細胞凋亡率、caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達的影響，旨在進一步探討H2S對缺血受損心肌的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 NaHS、溴化乙啶(ethidium bromide，EB)，美國Sigma公司。考馬斯亮藍試劑盒購自南京建成生物工程研究所。兔抗活化型caspase-3單抗，武漢博士德。鼠抗Bcl-2單抗、鼠抗Bax單抗、丙烯酰胺、N，N-亞甲雙丙烯酰胺，美國Santa Cruz公司。免疫組化檢測試劑盒、DAB試劑盒、辣根酶標記山羊抗兔購自北京中杉金橋生物技術公司。

1.2 儀器 電動勻漿器(Silentcrusher M，德國Heidolph公司)。電泳儀(DYY-Ⅲ7B型)。水浴式電轉膜儀(DYY-Ⅲ40B型)。顯微鏡(Olympus BX40型)。低溫高速離心機(德國Eppendorf)。流式細胞儀(Epics-XLⅡ型)。

1.3 實驗動物 健康♂Sprague-Dawley(SD)大鼠，8～10周齡，體質量(270±20)g，由河北省實驗動物中心提供。

1.4 模型制備及動物分組

1.4.1 大鼠急性心肌缺血模型制備 將大鼠用10%水合氯醛350 mg·kg－1腹腔注射麻醉，取仰臥位固定，剪去胸前手術區毛，碘酒消毒，用血管鉗沿第4肋間鈍性分離肋間肌約3 cm長，打開胸腔，撐開4、5肋骨剪開心包膜將心臟輕輕擠出，在左心耳與肺動脈圓錐之間平左心耳下緣迅速結扎冠狀動脈左前降支近段，立即關閉胸腔擠出胸腔內的氣體，以恢復負壓，幫助大鼠恢復自主呼吸。將肌肉層和皮膚分別縫合，制備急性心肌缺血模型。

1.4.2 動物分組與給藥 健康成年♂ SD大鼠40只隨機分為5組，每組8只，分別為:① 假手術組;②缺血組;③ 缺血 +NaHS低劑量組;④ 缺血 +NaHS中劑量組;⑤缺血+NaHS高劑量組。缺血組結扎左冠狀動脈前降支3 h時腹腔注射2 ml·kg－1生理鹽水，缺血+NaHS低、中、高劑量組分別于結扎左冠狀動脈前降支3 h時腹腔注射0.78、1.56和3.12 mg·kg－1的NaHS(用時現用生理鹽水配置，均為2 ml·kg－1)，假手術組只穿線不結扎，各組大鼠均于結扎左冠狀動脈前降支6h時處死，取心臟備用。取心尖部分心肌置于10%甲醛溶液中固定用于免疫組化法檢測;置于 －80℃冰箱保存，進行Western blot分析;置于70%的乙醇溶液中固定用于FCM測定。

1.5 檢測指標和方法

1.5.1 流式細胞術(flow cytometry，FCM)檢測心肌細胞凋亡 于實驗結束后取心尖部，剪碎，70%冷乙醇固定。棄去固定組織的70%酒精，生理鹽水沖洗心肌組織塊，在100目的不銹鋼網上研磨，邊研磨邊用PBS沖洗于容器中，用200目銅網過濾并收集懸液，1 000 r·min－1，離心 10 min，棄上清，用 PBS 制成單細胞懸液。應用美國Beckman-Coulter公司生產的Epics-XLⅡ型流式細胞儀，激發光源300 mW氬離子激光器，激發波長488 nm，檢測前調整儀器CV值在2%以內。每個樣本檢測10 000個細胞，以DNA組方圖出現低于G1期DNA含量的亞G1峰的大小代表凋亡細胞的多少，用Expo32 ADC軟件分析處理免疫熒光數據，計算凋亡百分率。

1.5.2 Western blot檢測 caspase-3蛋白表達 將裂解的心肌組織離心，上清液與點樣緩沖液熱變性，做聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，用吐溫-PBS洗滌，5%脫脂奶粉封閉，加稀釋的caspase-3一抗，再加相應的二抗，DAB顯色后立即用水沖洗，照相，經掃描后用美國UVP公司Lab Works 4.5軟件處理，確定相對吸光度值(每次對照的吸光度值為相對值1)。

1.5.3 免疫組化法檢測Bcl-2和Bax蛋白表達采用ABC法，DAB顯色。Bcl-2、Bax陽性表達呈棕黃色顆粒。每張切片隨機選取10個高倍視野，分別計數陽性表達心肌細胞數和心肌細胞總數并進行匯總，計算蛋白表達陽性心肌細胞數占心肌細胞總數的百分率。

1.6 HE染色觀察心肌組織學變化 于實驗結束后摘取心臟，冰生理鹽水沖凈血液，取左心室前壁部分組織，4%多聚甲醛固定，用70% ～100%的酒精梯度脫水，二甲苯中透明兩次，入石蠟內進行包埋，將修好的石蠟塊固定于石蠟切片機上切片，厚度為4 μm，將完全展開的石蠟片貼附于清潔載玻片上，4℃ 保存備用，常規HE染色。

2 結果

2.1 心肌缺血后細胞凋亡率的變化 心肌缺血6 h后缺血組大鼠心肌組織細胞凋亡率明顯高于假手術組(P＜0.01);NaHS 3個劑量組大鼠心肌組織細胞凋亡率明顯低于相應的缺血組(P＜0.05或P＜0.01，Tab 1，Fig 1)。

2.2 心肌缺血后細胞Bcl-2、Bax蛋白表達及Bcl-2/Bax比值的變化 免疫組化結果顯示，Bcl-2和Bax蛋白陽性表達呈棕黃色顆粒，主要在心肌細胞和內皮細胞胞質表達，假手術組大鼠心肌細胞可見少量的Bcl-2和Bax蛋白陽性細胞，缺血組大鼠心肌細胞可見少量的Bcl-2和大量Bax蛋白陽性細胞，與假手術組比較，缺血組大鼠心肌細胞Bax蛋白表達明顯升高(P＜0.01)，Bcl-2蛋白表達無明顯變化(P＞0.05)，Bcl-2/Bax比值明顯降低(P＜0.01)。與缺血組比較，缺血3 h時給予NaHS低、中、高劑量治療大鼠心肌組織Bcl-2蛋白表達明顯升高(P＜0.01)，Bax蛋白表達明顯降低(P＜0.01)，Bcl-2/Bax比值明顯升高(P ＜0.01，Tab 1，Fig 2，3)。

Tab 1 Effects of NaHS on the apoptosis rate and the expression of caspase-3，bcl-2 and Bax，and bcl-2/Bax in myocardium after ischemia in rats(±s，n=8)

Tab 1 Effects of NaHS on the apoptosis rate and the expression of caspase-3，bcl-2 and Bax，and bcl-2/Bax in myocardium after ischemia in rats(±s，n=8)

＊＊P ＜0.01 vs sham group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs ischemia group

Group Apoptotic/% caspase-3(RD)Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax Sham 12.11 ±2.31 1.00 ±0.00 12.80 ±1.62 15.69 ±1.73 0.82 ±0.05 Ischemia 21.37 ±2.13＊＊ 3.94 ±0.39＊＊ 9.43 ±1.47 29.11 ±2.28＊＊ 0.32 ±0.02＊＊ischemia+NaHS(L)18.37 ±1.64# 3.2 ±0.35# 17.65 ±1.96# 21.08 ±1.47## 0.84 ±0.04##ischemia+NaHS(M)15.12 ±1.25# 2.68 ±0.33# 18.87 ±1.13## 19.27 ±1.23## 0.98 ±0.06##ischemia+NaHS(H)13.14 ±1.33## 2.50 ±0.25## 21.24 ±2.02## 17.67 ±1.59## 1.20 ±0.52##

Fig 1 Change of the apoptosis rate(%)in myocardium after ischemia in rats

2.3 心肌組織的形態學變化 HE染色光鏡觀察結果顯示，假手術組大鼠心肌細胞排列整齊，著色均勻。缺血組大鼠部分區域心肌纖維橫紋不齊或消失，核偏移甚至裂解消失，有炎性因子滲出。NaHS低、中、高劑量治療組大鼠心肌缺血損傷程度明顯減輕(Fig 4)。

2.4 心肌缺血后caspase-3蛋白表達的變化Western blot檢測結果顯示，假手術組大鼠心肌細胞僅有少量的caspase-3的表達;缺血后各組caspase-3表達量均明顯增加，缺血3 h治療3 h時，NaHS低、中、高劑量組與缺血組比較，心肌細胞caspase-3表達明顯降低 (P ＜0.05，Tab 1，Fig 5)。

3 討論

細胞凋亡作為細胞主動死亡形式具有復雜的分子生物學機制，受許多因素的影響，細胞凋亡的發生主要受細胞內凋亡調節蛋白的調控，細胞凋亡的發生是促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間平衡喪失的結果，Bcl-2家族在各類刺激信號引起的凋亡中起關鍵作用［4］，其中Bcl-2和Bax是與凋亡密切相關的基因，Bcl-2為凋亡抑制基因，是膜的整合蛋白，在線粒體參與的凋亡途徑中起調控作用，能控制線粒體中細胞色素C等凋亡因子的釋放，抑制細胞凋亡，而Bax則介導細胞凋亡。當Bcl-2過量時，形成Bcl-2同源二聚體，細胞受到保護。當Bax過量時，形成Bax同源二聚體，細胞則趨向凋亡，Bcl-2的抗凋亡作用是通過與Bax組成異源二聚體，從而阻止Bax介導凋亡的作用，因此，在凋亡刺激因子(如細胞色素C、凋亡誘導因子、核酸內切酶G)等作用下，這兩種蛋白的比例決定了細胞是凋亡還是存活［5］。caspase家族是細胞凋亡的啟動者和執行者，其中caspase-3是caspase級聯下游一種與細胞凋亡密切相關的蛋白酶［6］。正常情況下，胞質中caspase-3以無活性的酶原形式存在，激活后可引起細胞凋亡，研究表明，心肌缺血/再灌注損傷的心肌中存在大量的凋亡細胞，認為心肌缺血可通過誘導氧化應激狀態和促進死亡受體及配體的表達激活caspase-3，引起心肌細胞凋亡［7－9］。Bcl-2可通過干擾細胞色素C的釋放而阻斷上游caspase-3蛋白酶的激活，抑制細胞凋亡。Bax蛋白作為線粒體膜上離子通道的組成成分，使細胞色素 C得以穿過線粒體膜，激活caspase-9，進一步激活 caspase-3，導致細胞凋亡［10－11］。

Fig 2 Change of the expression of Bax in myocardium after ischemia in rats

Fig 3 Change of the expression of Bcl-2 in myocardium after ischemia in rats

Fig 4 Pathological changes of myocardium by optical microscope after ischemia in rats(×400)

Fig 5 Change of the expression of Caspase-3 in myocardial tissue in rats

本實驗結果顯示，急性心肌缺血后，心肌損傷明顯，caspase-3蛋白表達明顯增加，Bcl-2蛋白表達降低，Bax蛋白表達則明顯升高，Bcl-2/Bax比值降低。假手術組大鼠心肌細胞可見較弱的caspase-3表達，可能是手術刺激所致。缺血后3 h經 H2S供體NaHS治療，心肌缺血損傷明顯減輕，心肌細胞caspase-3蛋白表達明顯降低，Bcl-2蛋白表達明顯升高，Bax蛋白表達明顯降低，Bcl-2/Bax比值明顯升高。因此，在心肌缺血后，H2S減輕心肌缺血損傷、抑制急性心肌缺血損傷引起細胞凋亡的機制可能與上調Bcl-2蛋白表達，下調Bax、caspase-3蛋白表達，升高Bcl-2/Bax比值有關，但是對其他細胞凋亡相關蛋白是否也有影響以及相關的作用機制，尚需進一步深入研究。

［1］ Olivetti G，Quaini F，Sala R，et al.Acute myocardial iinfarction in humans is associated with activation of programmed myocyte cell death in the surviving portion of the heart［J］.J Mol Cell Cardiol，1996，28(9):2005 －16.

［2］ 劉 芳，張建新，李蘭芳，等.硫化氫對急性心肌缺血大鼠心肌線粒體損傷的影響［J］.中國應用生理學雜志，2011，27(2):158－62.

［2］ Liu F，Zhang J X，Li L F，et al.Effects of hydrogen sulfide on myocardial mitochondrial injury during acute myocardial ischemia in rats［J］.Chin J Appl Physiol，2011，27(2):158 － 62.

［3］ 劉 芳，張建新，李蘭芳，等.硫化氫對大鼠急性心肌缺血損傷心肌功能的影響［J］.中國藥理學通報，2010，26(10):1334－8.

［3］ Liu F，Zhang J X，Li L F，et al.Effects of hydrogen sulfide on cardial function induced by acute myocardial ischemia in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(10):1334 －8.

［4］ Babu P P，Suzuki G，Ono Y，et al.Attenuation of ischemia and/or reperfusion injury during myocardial infarction using mild hypothermia in rats:an immunohistochemical study of bcl-2，bax，Bak and TUNEL［J］.Pathol Int，2004，54(12):896 －903.

［5］ McCintock D S，Santore M T，Lee V Y，et al.Bcl-2 family memders and functional electron transport chain regulate oxygen deprivation-induced cell death［J］.Mol Cell Biol，2002，22(1):94 －104.

［6］ 李 琴，郭云良，李 霞，等.胡黃連苷對大鼠腦缺血/再灌注損傷Caspase-3和PARP表達的影響［J］.中國藥理學通報，2010，26(3):342 －5.

［6］ Li Q，Guo Y L，Li X，et al.The interference of picrosideⅡ on the expression of Caspase-3 and PARP folowing cerebral ischemia reperfusion injury in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(3):342－5.

［7］ 尹瑞興，卡扎里，劉唐威，等.普羅布考對缺血/再灌注心肌細胞凋亡的作用［J］.中國臨床康復，2004，8(24):5202－4.

［7］ Yin R X，Ka Z L，Liu T W，et al，Effect of Probucol on the cardiomyocyte apoptosis during ischemia and reperfusion［J］.Chin J Clin Rehabil，2004，8(24):5202 －4.

［8］ 史婷婷，白建平，梁月琴，等.芹菜素對大鼠缺血/再灌注心肌細胞凋亡及相關蛋白 Bcl-2、Bax、Caspase-3表達的影響［J］.中國藥理學通報，2011，27(5):666 －70.

［8］ Shi T T，Bai J P，Liang Y Q，et al.Effect of apigenin on the cardiomyocyte apoptosis in rats with ischemia and reperfusion and the expression of Bcl-2，Bax，Caspase-3［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(5):666 －70.

［9］ 張羽冠，宋宏宇，李 鎣，等.蒺藜皂苷預適應對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護作用［J］.中國藥理學通報，2010，26(6):714 －8.

［9］ Zhang Y G，Song H Y，Li Y，et al.Protective effect of GSTT preconditioning on myocardial ischemia-reperfusion injury in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(6):714 －8.

［10］ Voutsadakis I A.Apoptosis and the pathogenesis of lymphoma［J］.Acta Oncol，2000，39:151 －6.

［11］ Schon E A，Manfredi G.Neuronal degeneration and mitchondrial dysfunction［J］.Clin Invest，2003，119(3):303 －12.