灰氈毛忍冬與忍冬的藥理作用比較研究

張小娜，唐 清，侯 敏，李 燁，徐曉玉

(西南大學藥學院，重慶市藥效評價工程技術(shù)研究中心，重慶市銀花工程技術(shù)研究中心，西南大學中藥研究所，重慶 400716)

金銀花和山銀花均屬忍冬科植物，中醫(yī)臨床傳統(tǒng)使用歷史悠久，《中國藥典》2010年版將金銀花與山銀花分列，并將灰氈毛忍冬 L.macranthoides Hand.-Mazz作為山銀花的來源之一［1］。金銀花與山銀花的性味歸經(jīng):甘，寒，歸肺、心、胃經(jīng);功能與主治:清熱解毒，疏散風熱，用于癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫熱發(fā)病。截至目前，關(guān)于灰氈毛忍冬的藥理作用尚未見系統(tǒng)地研究和報道，本實驗將灰氈毛忍冬和忍冬(Lonicera japonica Thunb)的抗菌、抗炎及非特異性免疫調(diào)節(jié)作用進行了比較研究，旨在豐富藥典新收錄藥材的基礎研究。

1 材料與儀器

1.1 試驗藥物與主要試劑 灰氈毛忍冬(產(chǎn)自重慶秀山，購自重慶市秀山紅星中藥材開發(fā)有限公司，批號:110718，經(jīng)西南大學齊紅藝教授鑒定為忍冬科忍冬屬植物灰氈毛忍冬的干燥花蕾);忍冬(產(chǎn)自山東平邑，購自山東岐黃中藥飲片有限公司，批號:110501，經(jīng)西南大學齊紅藝教授鑒定為忍冬科忍冬屬植物忍冬的干燥花蕾);阿司匹林(太極集團西南藥業(yè)股份有限公司，批號:081101，規(guī)格:25 mg/片);角叉菜膠(生工生物工程上海有限公司，批號:51303，規(guī)格:500 g/瓶);香菇菌多糖片(開封制藥有限公司，批號:20090101，規(guī)格:10 mg/片);環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份公司，批號:08120521，規(guī)格:0.2 g/瓶)等。

1.2 主要儀器 ELx800型酶標儀，基因有限公司;EL-2046型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司;UV3010紫外分光光度計，日立高新技術(shù)公司;光學顯微鏡，泰盟科技有限公司。

1.3 動物 昆明種小鼠，♀、♂兼用，SPF級，體質(zhì)量18～22 g;SD大鼠，♂，SPF級，體重150～200 g。以上動物均購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心。昆明種小鼠質(zhì)量合格證號:No 0003962，SD大鼠質(zhì)量合格證號:No 0000022，動物生產(chǎn)許可證號:SCXD(渝)2007～2006。

1.4 樣品溶液制備 取灰氈毛忍冬和忍冬各適量，水提醇沉后濃縮成 0.25、0.5、1.0、2.0 g·ml－1儲備液，進行抗炎和免疫調(diào)節(jié)預實驗，結(jié)果表明濃度為1.0 g·ml－1效果最好，最終確定此濃度為正式試驗給藥濃度。

2 方法

2.1 抗菌實驗［2－3］取灰氈毛忍冬和忍冬各適量煎煮，過濾，除菌，濃縮后，將其分別稀釋成1 000、500、250、125 、62.8、31.4、15.7、7.8 g·L－18 個濃度備用。

2.1.1 最小抑菌濃度(MIC)測定 在96孔板中加樣如下:試驗孔1#－8#孔:培養(yǎng)基100 μl+菌液20 μl，再分別加入稀釋好的8個濃度的藥液120 μL;陰性對照孔9#孔:培養(yǎng)基220 μl+菌液 20 μl;陽性對照孔10#孔:培養(yǎng)基100 μl+2萬單位青霉素鈉溶液120 μl+ 菌液20 μl;培養(yǎng)基對照孔11#孔:培養(yǎng)基240 μl;空白對照孔:僅加對應濃度的藥物和培養(yǎng)基。加完后密封，混勻后置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察各孔細菌生長情況，于630 nm下測各孔吸光度，依據(jù)吸光度計算MIC。

2.1.2 最小殺菌濃度(MBC)測定 根據(jù)MIC測定結(jié)果，分別吸取未見細菌生長的各管培養(yǎng)液50 μl，涂布于瓊脂平板中，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。平皿上菌落數(shù)小于5的最小稀釋度的藥物濃度即為MBC。

2.2 抗炎實驗

2.2.1 對醋酸致毛細血管通透性增加的影響［4］昆明種小鼠50只，♂，隨機分為5組，ig給藥，每日1次，連續(xù)7 d。末次給藥0.5 h后尾iv質(zhì)量濃度為5 g·L－1伊文斯藍溶液0.01 ml·g－1，隨即 ip 體積分數(shù)為0.006 的醋酸溶液0.01 ml·g－1，0.5 h 后處死，生理鹽水6 ml洗出腹腔內(nèi)伊文斯藍溶液4 ml，3 000 r·min－1離心10 min，590 nm處測定上清液吸光度值，由標準曲線得出每只小鼠腹腔滲入染料量。

2.2.2 對角叉菜膠致大鼠足腫脹的抑制作用［5］SD大鼠40只，♂，隨機分為5組，ig給藥，每日1次，連續(xù)7 d。末次給藥前，在大鼠左后足踝處標定測量基線，測量大鼠足趾體積2次，以平均值為基礎值。ig給藥0.5 h后，于左足趾皮下注射10 g·L－1角叉菜膠 0.1 ml/只，分別于致炎后 0.5、1、2、4、6 h測量足趾體積，計算各組腫脹值(各時間點足趾體積－基礎值)和抑制率。抑制率/%=(模型組足腫脹度－用藥組足腫脹度)/模型組足腫脹度×100%。

2.2.3 對棉球誘導大鼠肉芽組織增生的影響［6］SD大鼠36只，♂，隨機分為4組，ig給藥，每日1次，給藥7 d后，水合氯醛麻醉，在大鼠兩側(cè)肩胛處剪開約1 cm的小口，將棉球分別植入兩側(cè)肩胛處皮下，縫合創(chuàng)口。繼續(xù)ig給藥5 d后處死，取出棉球，去除結(jié)締組織，60℃烘箱放置12 h，稱重，減去原棉球重量，即為肉芽腫凈值，取兩側(cè)肉芽腫質(zhì)量的均值，計算抑制率。抑制率/%=(模型組肉芽腫重量－用藥組肉芽腫重量)/模型組肉芽腫重量 ×100%。

2.3 免疫調(diào)節(jié)實驗

2.3.1 對免疫低下小鼠免疫器官重量的影響［7］昆明種小鼠50只，♀、♂各半，隨機分為5組，ig給藥，每天1次，連續(xù)15 d，除空白組外，其余組d10每鼠ip環(huán)磷酰胺100 mg·kg－1，每天1次，連續(xù)3 d，d16取脾臟和胸腺，以脾重(mg)/體重(10 g)和胸腺重(mg)/體重(10 g)作為脾臟和胸腺指數(shù)。

2.3.2 對免疫低下小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響［8］分組給藥方法同上，除正常組外，其余組d10每鼠ip環(huán)磷酰胺100 mg·kg－1，每天1次，連續(xù)3 d。末次給藥2 h后，每鼠尾iv印度墨汁0.01 ml·g－1。分別于2 min(T1)和10 min(T2)后從眼球取血 60 μl加到 6 ml 1 g·L－1Na2CO3溶液中，575 nm波長處測OD值。稱體重和肝脾重量，計算碳廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α。K=(lgA1－lgA2)/(T2－T1)，α =K1/3×體重/(肝重+脾重)。

3 結(jié)果

3.1 抗菌實驗結(jié)果

3.1.1 MIC的測定結(jié)果 培養(yǎng)結(jié)束后肉眼可見，培養(yǎng)基對照孔、空白對照孔顏色、透明度均無變化;陰性對照孔液體渾濁，有白色沉淀產(chǎn)生;兩種藥材高濃度(1 000、500、250、125 g·L－1)孔也無外觀變化;低濃度孔(62.8、31.4、15.7、7.8 g·L－1)有變色現(xiàn)象，液體變渾濁。由Tab 1結(jié)果可以看出兩種藥材對6種常見致病菌均有不同程度的抑菌作用，灰氈毛忍冬對八疊球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌作用比忍冬強，對其他3種菌的抑菌作用均弱于忍冬。

3.1.2 MBC的測定結(jié)果 培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)基對照組無細菌生長;陰性對照組有大量菌落生長，說明實驗結(jié)果可靠。兩種藥材對6種常見致病菌均有不同程度的殺菌作用(Tab 2)。結(jié)果顯示，灰氈毛忍冬對八疊球菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的殺菌效果均比忍冬強，對綠膿桿菌和傷寒桿菌與忍冬相當，對大腸桿菌較忍冬弱。

3.2 抗炎實驗結(jié)果 與模型組相比灰氈毛忍冬1 g·kg－1和忍冬1 g·kg－1均能明顯抑制小鼠腹腔毛細血管通透性(P＜0.01);降低大鼠足腫脹度(P＜0.05)和抑制大鼠肉芽組織增生(P＜0.01)，且二者比較差異無顯著性(P＞0.05)。結(jié)果見Tab 3、4、5。

3.3 免疫調(diào)節(jié)實驗結(jié)果 灰氈毛忍冬1 g·kg－1和忍冬1 g·kg－1均能明顯提高小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)(P＜0.01)。以上指標灰氈毛忍冬和忍冬均差異無顯著性(P＞0.05)。結(jié)果見Tab 6。

4 討論

忍冬屬植物提取物中化學成分復雜，主要含有綠原酸、黃酮類、皂苷類等，目前仍以綠原酸含量衡量其質(zhì)量優(yōu)劣，有文獻［9］研究表明灰氈毛忍冬中綠原酸含量為忍冬的2倍，體外抗菌試驗發(fā)現(xiàn)，灰氈毛忍冬對革蘭氏陽性菌的殺菌能力強于忍冬，因此，綠原酸對革蘭氏陽性菌的殺菌能力是否呈劑量依賴關(guān)系值得研究;同時，忍冬對大腸桿菌的殺菌能力強于灰氈毛忍冬，對綠膿桿菌、金葡菌、傷寒桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌能力也強于后者，說明了該類藥材的抗菌效果并不完全依賴于綠原酸含量，可能有其他成分起協(xié)同作用;體內(nèi)抗炎、免疫調(diào)節(jié)試驗結(jié)果差異無顯著性，可能與灌胃給藥方式下綠原酸生物利用度低有關(guān)［10］，但也可能是由提取物中其他有效成分所致。總之，該實驗結(jié)果表明了灰氈毛忍和忍冬在上述藥理活性上強度相當，為該藥材的廣泛應用提供了理論依據(jù)，而在抗病毒、抗氧化、保肝利膽等方面二者是否存在相同或不同的藥效有待進一步研究。

Tab 1 Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on MIC in six kinds of pathogenic bacteria(g·L－1)

Tab 2 Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on MBC in six kinds of pathogenic bacteria(g·L－1)

Tab 3Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on abdominal capillary permeability in mice(±s，n=10)

Tab 3Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on abdominal capillary permeability in mice(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs normal;##P＜0.01 vs model group

Group Dose/g·kg－1 Inhibitory ratio/%Normal – 0.08 ±0.07 0.04 Abdominal capillary permeability A Azovan blue/mg·L－1–Model – 0.77 ±0.28＊＊ 1.04 0 APC 0.2 0.20 ±0.16## 0.22 78.85 L.macranthoides Hand-Mazz 1 0.37 ±0.07## 0.46 55.77 Lonicera japonica Thunb 1 0.44 ±0.13##0.57 45.19

Tab 4 Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on carrageenan-paw edema in rats(±s，n=8)

Tab 4 Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on carrageenan-paw edema in rats(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs normal group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs model group

Group Dose/g·kg－1 Content after paw edema/ml Inhibitory ratio after paw edema/%Before edema/ml 0.5 h 1 h 2 h 4 h 6 h Normal － 1.06 ±0.07 0.000.43 0.02 ±0.03 0.03 ±0 0.5 h 1 h 2 h 4 h 6 h.04 0.04 ±0.05 0.03 ±0.04 － － － － －Model - 1.11 ±0.12 0.15 ±0.07＊＊ 0.21 ±0.07＊＊ 0.29 ±0.14＊＊ 0.33 ±0.14＊＊ 0.41 ±0.16＊＊ 0 0 0 0 0 APC 0.2 1.04 ±0.06 0.13 ±0.04 0.17 ±0.08 0.17 ±0.10# 0.24 ±0.11 0.24 ±0.09## 13.33 19.05 41.38 27.27 41.6 L.macranthoides Hand.-Mazz 1 1.12 ±0.07 0.10 ±0.04＊＊ 0.12 ±0.06## 0.15 ±0.09## 0.22 ±0.10# 0.23 ±0.12## 33.33 42.86 42.28 33.3 43.0 Lonicera japoni ca Thunb 1 1.11 ±0.07 0.09 ±0.02## 0.11 ±0.04## 0.21 ±0.15 0.31 ±0.15 0.30 ±0.17 40.0 47.62 27.59 0.03 26.3

Tab 5 Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on cotton pellet-induced granuloma in rats(±s，n=9)

Tab 5 Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on cotton pellet-induced granuloma in rats(±s，n=9)

＊＊P＜0.01 vs model group

Group Dose/g·kg－1 Model - 40.5 ±5.1 0 APC 0.2 17.5 ±4.3＊＊ 56.8 L.macranthoides Hand.-Mazz 1 25.2 ±7.4＊＊ 37.8 Lonicera japonica Thunb 1 29.5 ±7.3＊＊Increased weight of granuloma/mg Inhibitory ratio/%27.2

Tab 6 Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on index of immune organ and phagocytosis of macrophages in mice(±s，n=10)

Tab 6 Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on index of immune organ and phagocytosis of macrophages in mice(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs model group

Group Dose/g·kg－1 Index of immune organ Index of thymus/mg·(10 g)－1 Index of spleen/mg·(10 g)－1 Phagocytosis of macrophages K/×10－2α Normal － 13.77 ±2.16 25.91 ±3.91 2.75 ±0.79 6.28 ±0.99 Model - 6.13 ±0.61＊＊ 14.14 ±1.90＊＊ 0.55 ±0.30＊＊ 3.21 ±0.70＊＊LNT 0.0045 9.71 ±1.30## 21.41 ±1.69## 1.70 ±0.70## 5.24 ±1.00##L.macranthoides Hand.-Mazz 1 9.18 ±1.16## 20.08 ±2.34## 1.80 ±0.65## 5.21 ±1.03##Lonicera japonica Thunb 1 8.43 ±1.29## 19.63 ±2.42## 1.56 ±0.74## 4.74 ±1.00##

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