大黃素對鼻咽癌CNE-1細胞放射增敏作用與細胞自噬關系的研究

陳冬蓮，侯華新，鄭 華，梁 燕，黎丹戎

(廣西醫科大學藥學院，廣西南寧 530021)

越來越多的研究表明自噬在腫瘤發生發展中起著重要作用，且腫瘤的放化療過程可誘導細胞發生自噬性死亡，如Peng等［1］在研究小檗堿對A549放射增敏作用過程中發現放射增敏與細胞自噬能力之間有著緊密的聯系。本課題前期實驗已證實廣西產何首烏中無細胞毒作用濃度5 mg·L－1大黃素聯合2Gy射線照射對鼻咽癌細胞CNE-1具有明顯的放射增敏作用，放射增敏比為 1.39［2］，為了研究大黃素在放射增敏過程中是否伴隨著自噬的發生及其作用機制，本實驗通過電鏡觀察大黃素在放射增敏過程鼻咽癌細胞CNE-1自噬體形成的超微結構變化，real-time PCR定量檢測自噬相關基因的表達，探討放射增敏與自噬發生的關系。

1 材料

1.1 細胞來源 人鼻咽癌高分化CNE-1細胞由廣西醫科大學實驗中心提供。

1.2 主要試劑 大黃素由課題組前期從廣西何首烏分離獲得并經結構鑒定，純度為99%。實驗中加入無細胞毒作用濃度5 mg·L－1。TRIzol REAGENT(Invitrogen公司，美國)、異丙醇和三氯甲烷為國產分析純試劑、DEPC處理水、RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司，美國)、Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)(Roche公司出品)、滅菌注射用水、RPMI 1640(Gibco公司)

1.3 主要儀器 超低溫高速離心機5810 R(德國Eppendorf公司)、ABI 7300 Real-time PCR 儀、Nano Drop 2000(Thermo公司)、凝膠成像儀(BIO-RAD)、倒置相差熒光顯微鏡Axiovert 200。采用60Co射線(加拿大Theratronics產品)為照射源，劑量率94.41 cGy·min－1，根據實驗要求進行相應劑量的照射。

1.4 引物序列 根據 NCBI數據庫提供的人ULK1、GABARAPL1、Beclin1、Bcl-2 核酸序列，設計特異PCR引物，以β-actin作為內參照，引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成，其引物序列及產物大小見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences and product lengths

2 方法

2.1 細胞培養 細胞于37℃ 體積百分數為5%CO2培養箱內，以含體積百分數為10%小牛血清的RPMI 1640培養液在培養瓶內單層傳代培養，取對數生長期細胞進行實驗。

2.2 實驗分組 實驗分成4組，空白對照(A組):用1640完全培養基培養。大黃素(B組):給予無細胞毒終濃度為5 mg·L－1的大黃素，藥物作用24 h，繼續培養16 h。照射(C組):給予60Co2Gy照射后，繼續培養16 h。放射增敏(D組):終濃度為5 mg·L－1大黃素作用細胞24 h后給予60Co2Gy照射，細胞繼續培養16 h。

2.3 透射電鏡觀察細胞超微結構 各組細胞經上述處理后，用PBS漂洗細胞表面3次，胰酶消化后將細胞離心成團，加入預冷的質量分數為3%戊二醛，4℃過夜，送檢。

2.4 Real-time PCR法檢測ULK1、GABARAPL1、Beclin1和Bcl-2 mRNA表達 各組細胞經上述處理后，提取細胞總RNA，經Nano Drop 2 000定量測定濃度，1.9≤A260/A280≤2.1，10 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。取2 μg總 RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書進行cDNA的合成。PCR反應條件見Tab 2。

Tab 2 PCR amplification reaction conditions of target gene

參照文獻［3］的方法建立標準曲線。根據以下公式求出目的基因相對表達指數 F=10△CT，T/AT△CT，R/AR

該公式中，△CT，T表示實驗組減去空白對照組目的基因Ct值的差，△CT，R表示實驗組減去空白對照組內參基因Ct值的差，AT表示目的基因標準曲線的斜率，AR表示內參基因標準曲線的斜率，F表示的是實驗組目的基因相對于空白對照組的表達量，將其作為定量結果并用于分析。

3 結果

3.1 鼻咽癌各組細胞超微結構的變化 在透射電鏡下，與空白對照組比較，各實驗組均觀察到細胞胞質中空泡增多，線粒體腫脹變性，在這些變性的細胞器周圍出現空泡狀結構，有的被雙層膜環繞，形成典型的自噬體和自噬溶酶體的自噬現象，以大黃素組和放射增敏組尤為明顯，結果見Fig 1。

Fig 1 Autophagosomes found under TEM(n=3)

3.2 鼻咽癌各組細胞自噬相關基因表達情況ULK1、Beclin1、GABARAPL1、Bcl-2 基因的熒光定量PCR擴增曲線基本擬合良好，各基因標準曲線的相關系數0.99以上和擴增效率90% 以上，說明 PCR反應體系穩定，結果可靠。各實驗組基因mRNA表達情況結果見Fig 2。

Fig 2 ULK1，GABARAPL1，Beclin1，Bcl-2 mRNA expression in different groups of CNE-1 cells(n=3)

與空白組比較，各組ULK1mRNA表達均升高(P＜0.05)，其中大黃素增敏組表達最高(P＜0.01);而Beclin1和Bcl-2 mRNA表達下調，但與對照組比較差異無統計學意義;GABARAPL1除大黃素增敏組明顯升高外(P＜0.05)，其它各組變化不明顯(P＞0.05)。

4 討論

細胞自噬是生物有機體適應不同環境的有效的內部調節機制，它的發生發展主要分為4個階段［4］:①細胞受到誘導，在胞質內形成小而扁平的由雙層膜構成的自噬泡;②自噬泡延伸，包裹受損的細胞器和變性蛋白及核酸等，形成密閉的球狀自噬體;③自噬體可與細胞內吞的吞噬泡、吞飲泡等;④形成自噬溶酶體。自噬過程中出現的特殊結構及其形態，可以通過透射電鏡觀察到。本研究的電鏡結果發現除空白對照組外，其余各組均出現了自噬泡或自噬體，特別是大黃素放射增敏組出現大量的自噬體及自噬溶酶體。可以推測，大黃素放射增敏作用可能與大黃素屬于生物還原性物質，易于穿透細胞膜，聚集于胞質內，產生活性氧，引起細胞線粒體等細胞器的損傷，導致細胞的過度自噬有關。

細胞自噬往往是一把雙刃劍，它可使細胞器自我更新，維持細胞自身代謝從而抵抗外部環境的影響，而自噬的過度激活又可導致細胞內各種細胞器受損，發生自噬性死亡。自噬的發生涉及多個基因、多條途徑的復雜的程序化過程，一系列自噬相關基因有序的參與其中。ULK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，當上游自噬信號被激活后，ULK1發生去磷酸化，與多種自噬相關基因形成啟動自噬的關鍵復合物，促進下游自噬信號激活［5－6］。GABARAPL1 主要結合于自噬體或溶酶體膜上，該基因的上調可使形成的獨特膜性結構(phagophore)不斷延伸，直至完全包裹待降解的細胞質組分 ，由此形成自噬體。當自噬體和溶酶體融合后，GABARAPL1表達量下降［7］。本研究發現，與空白對照細胞比較，低劑量射線、無細胞毒劑量大黃素與細胞作用后，細胞通過自噬，產生應急反應，促使細胞對抗環境的變化，保持細胞的穩定狀態而免受損傷。而放射增敏組的ULK1急劇升高，GABARAPL1 mRNA呈現過表達，可能此時過多的細胞器或者蛋白質進入自噬小泡而被降解，細胞的功能嚴重受損，出現不可逆的改變，從而導致細胞進入自噬性死亡階段。

有文獻研究表明，自噬與凋亡在某些情況下受控于同一刺激物并產生不同的細胞反應，兩者的相互作用取決于受試物和細胞所處的環境［8］。Beclin1基因是細胞自噬過程中重要的正調節因子。它主要通過與PI3K3C形成復合體來調節其它的自噬相關蛋白在自噬前體結構中定位［9］。已有文獻證實通過上調Beclin1在哺乳動物細胞中的表達能夠刺激自噬的發生。Bcl-2是調節凋亡的重要蛋白之一，定位于線粒體、內質網和連續的核膜上，Bcl-2 mRNA表達下降自噬增加。此外Beclinl可以通過BH3結構域與Bcl-2的相互作用并抑制自噬體形成。當細胞內環境穩定時，Beclin1與Bcl-2相互結合，抑制細胞自噬，當內環境被打破后，二者分離，Beclin1依賴的自噬增加［10］，可見 Beclin1與 Bcl-2表達與自噬和凋亡活性密切相關。本研究顯示，在不同的條件下，各組細胞Beclin1、Bcl-2 mRNA表達情況出現下降。這可能是由于細胞受到藥物或射線等刺激后，細胞內環境被破壞，Beclin1與Bcl-2結合程度不同，部分細胞進入了凋亡程序性死亡通道。究竟大黃素在放射增敏過程中如何實現對自噬性死亡和凋亡程序性死亡的調控，有待進一步深入研究。

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