川芎嗪對LPS致心肌細胞損傷的影響及機制研究

劉 丹，尹 東，曾 姝，何 明

(1.南昌大學醫學院藥理學教研室，2.江西省分子醫學重點實驗室，江西 南昌 330006)

四甲基吡嗪(TMPZ)又名川芎嗪，是從川芎的生物堿中分離得到的有效單體。川芎嗪有良好的心肌保護作用，主要與其具備抗鈣與抗自由基雙重作用有關［1－2］。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)為革蘭陰性細菌胞壁的重要成分，是引起炎癥反應和休克的關鍵介質之一，常引起全身炎癥反應并可導致多器官功能衰竭，累及心臟。有研究報道［3］，LPS可增加心肌細胞NADH氧化酶的表達及過氧化物增殖而導致心肌損傷。鑒于川芎嗪的抗氧自由基作用，我們假設川芎嗪可以保護LPS損傷的心肌細胞，目前尚未見報道。因此，本研究利用LPS誘導心肌細胞損傷，觀察川芎嗪對LPS誘導的心肌細胞損傷的影響，并檢測活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成、細胞的氧化應激狀態及NF-κB p65的核移位情況，探討川芎嗪對抗LPS損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 受試藥品與主要試劑 TMPZ:中國藥品生物制品檢定所，NF-κB p65、β-actin抗體及相應二抗:Santa Cruz;DCHF-DA:Molecular probes;胎牛血清:杭州四季青生物工程材料有限公司;MDA、SOD、GSH-Px檢測試劑盒:南京建成生物工程研究所;胞核-胞質蛋白制備試劑盒:北京普利萊基因技術有限公司;MEM培養基:Gibco BRL;LPS(傷寒菌內毒素脂多糖)、胰酶、HEPES、MTT、增強化學發光印跡試劑、硝酸纖維素膜(Amersham，UK)、丙烯酰胺、PMSF、亮肽素、SDS、亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、EDTA和DTT:Sigma公司;其它試劑均為分析純。

1.2 心肌細胞的分離培養 參照以前的實驗方法［4］，以出生1～3 d的SD乳鼠心室肌組織為實驗對象，0.1%胰酶消化分離，MEM培養基(含15%胎牛血清)混懸后放CO2培養箱(5%CO2，37℃)孵育2 h去除成纖維細胞，然后分別按5×105cells·well－1、1 ×105cells·well－1接種于 6 孔、96 孔培養板，隔天換培養液，前3 d加入0.1 mmol·L－1Brdu抑制纖維細胞生長。培養4 d隨機分組進行實驗。

1.3 藥物處理 用不同劑量的TMPZ預處理3 h，棄原培養基，用PBS清洗3次，換新的MEM培養基，再加LPS(5mg·L－1)繼續培養6 h，收集細胞進行實驗。每次實驗均分溶劑對照組(正常對照)、LPS處理組及藥物干預組(TMPZ+LPS)，每組至少重復6次，TMPZ用生理鹽水溶解。

1.4 細胞存活率 MTT比色法檢測細胞存活率。胰酶消化收集細胞，每組細胞以1×104cells·well－1濃度接種至96孔培養板中。細胞融合至80%左右開始檢測。吸棄原培養基，每孔加入20 μl MTT 溶液(5 g·L－1溶于PBS)，37 ℃，4 h，然后每孔加DMSO 150 μl振蕩10 min，使藍色結晶充分溶解，在490 nm波長處測定其光吸收值(OD值)。

1.5 生化檢測 各組處理結束后取上清200 μl，生化自動分析儀檢測LDH活性。

1.6 流式細胞法檢測心肌細胞內ROS含量 實驗結束后，用4℃預冷的PBS洗滌細胞2～3次，加入0.25%胰蛋白酶 (含0.02%EDTA)消化細胞后收集，將配制好的 10 μmol·L－1DCFH-DA 溶液 500 μl重懸細胞，37℃孵育30 min，離心，800 ×g，5 min，棄上清，預冷的PBS洗滌細胞2～3次，制成1×108cells·L－1的懸液，立即進行流式細胞儀檢測，以488 nm為激發波長，530 nm為發射波長。以不加DCFH-DA的一管為陰性對照。

1.7 細胞內丙二醛(MDA)含量、SOD及GSH-Px活性測定 實驗結束后，消化收集心肌細胞，反復凍融破碎細胞，離心后取上清液，按試劑盒說明書進行操作。

1.8 Western blot檢測 實驗結束后，按試劑盒說明書提取心肌細胞核蛋白，同等量蛋白質行SDSPAGE后，電轉膜，分別結合一抗、二抗，最后X線膠片曝光分析。

1.9 數據處理 應用SPSS11.5統計軟件行組間方差分析，各實驗組數據以±s表示。

2 結果

2.1 TMPZ對LPS致心肌細胞損傷的影響 如Fig 1，2 所示，心肌細胞用不同劑量(40、80、120 μmol·L－1)TMPZ 預處理 3 h，加入 10 mg·L－1LPS，心肌細胞的存活率隨TMPZ劑量的增大而升高，LDH值則隨TMPZ劑量的增大而減少，具有明顯的劑量依賴性。

Fig 1 Effects of TMPZ on viability of cardiac cells subjected to LPS-induced injury(±s，n=6)

Fig 2 Effects of TMPZ on LDH activity of cardiac cells subjected to LPS-induced injury(±s，n=6)

2.2 TMPZ劑量依賴性地減少ROS生成 流式細胞儀檢測結果顯示(Fig 3)，用10 mg·L－1LPS處理培養的心肌細胞，ROS生成明顯增加(與對照組比，P ＜0.01)，用40 ～120 μmol·L－1TMPZ 預處理心肌細胞3 h，從 40 μmol·L－1TMPZ 開始，ROS 生成明顯降低(與LPS處理組相比，P＜0.01)。說明隨著藥物濃度的增加，ROS的生成逐漸減少。

2.3 TMPZ劑量依賴性地抑制NF-κB p65核移位

Western blot結果顯示(Fig 4)，用10 mg·L－1LPS處理培養的心肌細胞，核蛋白中NF-κB p65蛋白含量明顯增加(與對照組比，P＜0.01)，用40～120 μmol·L－1TMPZ 預處理心肌細胞3 h，從40 μmol·L－1TMPZ開始，核蛋白中NF-κB p65蛋白含量明顯降低(與LPS處理組相比，P＜0.01)。說明隨著藥物濃度的增加，抑制NF-κB p65蛋白向細胞核的轉移。

2.4 TMPZ劑量依賴性地抑制脂質過氧化，提高抗氧化酶活性 如Fig 5所示，用10 mg·L－1LPS處理培養的心肌細胞，MDA含量明顯增加，SOD及GSH-Px活性下降(與對照組比，P＜0.01)，用40～120 μmol·L－1TMPZ 預處理心肌細胞 3 h，從 40 μmol·L－1TMPZ開始，MDA 含量開始下降，SOD 及GSH-Px活性增加(與LPS處理組相比，P＜0.01)。說明隨著藥物濃度的增加，脂質過氧化被抑制，抗氧化酶活性增加。

3 討論

LPS是革蘭陰性細菌致病的主要因素，它可引起機體的一系列炎癥反應，是一種重要的致炎因子［5］。根據文獻報告［3，6］，LPS可增加心肌細胞NADH氧化酶的表達及過氧化物增殖，造成ROS生成增加。ROS具有較高的反應活性，正常情況下，細胞存在抗氧化酶類，包括SOD、GSH-Px等，能夠清除細胞代謝過程中不斷產生的ROS，使得細胞內ROS的生成與清除處于一個相對穩定的水平。但當其生成較多，超過細胞抗氧化酶類的清除水平時，會造成細胞的廣泛損傷，如膜脂質過氧化、蛋白質及核酸損傷等。因此，刺激心肌細胞產生過多的ROS可能是LPS誘導心肌細胞損傷的機制之一。我們的研究證實，LPS處理心肌細胞后，會使得MDA含量升高，SOD、GSH-Px活性下降，ROS含量增加，心肌細胞存活率減少。

Fig 3Effects of TMPZ on ROS production of cardiac cells subjected to LPS-induced injury(±s，n=6).

Fig 4 Effects of TMPZ on nuclear NF-κB p65 protein of cardiac cells subjected to LPS-induced injury by Western blot(±s，n=6)

TMPZ是中藥川芎的主要有效成份之一，許多研究［7－8］均報道川芎嗪有心血管保護作用，并且這種保護作用與其抗氧化作用有關。我們在LPS損傷心肌細胞之前給予不同劑量的TMPZ預處理，發現有明顯的保護作用，且這種保護作用呈劑量依賴性;進一步對TMPZ抗LPS損傷的機制進行研究，發現與抑制 NF-κB 激活有關。眾所周知［9］，NF-κB 信號傳導通路被認為是LPS所介導的信號傳導通路中最重要的下游通路。一般情況下，NF-κB為p50/p65異源二聚體，與抑制物IκBα結合成無活性的三聚體存在于細胞質中;一旦受到外界因素刺激時，如大量產生的 ROS，IκBα 磷酸化而迅速降解，NF-κB即被激活，p65由細胞質移位至細胞核，從而調控一系列基因表達［10］。在LPS誘導的心肌細胞損傷中，NF-κB的激活很有可能引起大量炎癥因子如TNF-α、IL-1等的過度表達，從而造成細胞損傷。我們的實驗結果表明，LPS能促進p65的核移位，使p65在核中的表達明顯升高，而TMPZ則呈劑量依賴性抑制p65的核移位，從而起到對抗LPS致心肌細胞損傷的作用。因此，可以推斷川芎嗪對LPS所致的心肌損傷有保護作用，其機制主要是通過減少ROS生成，從而抑制NF-κB的活化，阻止p65的核移位，減少炎癥因子的表達，發揮心肌保護作用。

Fig 5 Effects of TMPZ on content of MDA，SOD and GSH-Px activities of cardiac cells subjected to LPS-induced injury(±s，n=6)

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