DIDS對(duì)SIN-1誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及PARP-1/AIF表達(dá)的影響

李 曦，尹金寶，鐘志超，范洪領(lǐng)，許黎娟，鄭原印，蔡仕寧，常全忠

(1.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生理學(xué)教研室，廣東珠海 519041;2.廣東醫(yī)學(xué)院東莞校區(qū)病理學(xué)教研室，廣東 東莞 523770)

資料顯示，氯通道可能在多種非神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中起重要的作用［1－2］。Takahashi等［3］在轉(zhuǎn)基因小鼠中利用STS誘導(dǎo)培養(yǎng)心肌細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示氯通道阻斷劑DIDS和NPPB能夠抑制缺血心肌細(xì)胞的凋亡，認(rèn)為ClC-3氯通道可能參與缺血心肌細(xì)胞的凋亡。

目前對(duì)氯通道是否參與缺血性腦損傷后海馬神經(jīng)元的凋亡過程報(bào)道甚少。本研究模擬腦缺血性腦損傷一氧化氮(NO)過量產(chǎn)生的機(jī)制，利用SIN-1作為NO供體誘導(dǎo)離體大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，試圖通過觀察氯通道的活動(dòng)是否參與了神經(jīng)元的凋亡過程，探討缺血缺氧敏感性神經(jīng)元的凋亡與氯通道之間的關(guān)系，為臨床腦缺血神經(jīng)元損傷產(chǎn)生機(jī)制的研究和治療提供新的實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑 新生1 d SD大鼠由遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供;Neurobasal培養(yǎng)基、B27購(gòu)自Gibco BRL公司，多聚賴氨酸(poly-D-Lysine，PLL)、阿糖胞苷、DIDS(4，4'-diisothiocyanatostilbene-2，2'disulfonic acid)、MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium)SIN-1(3-morpholinosyndnomine)、Poly(ADP-ribose)polymerase-1(PARP-1)、Apoptosis-inducing factor(AIF)和Hoechst 33258等試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;胎牛血清(杭州四季青公司);二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(香港試劑公司);Anti-Caspases-3(Santa Cruz)。

1.2 海馬神經(jīng)元的培養(yǎng) 參照方法［4］取生1 d內(nèi)的SD大鼠，♀♂不拘，無菌斷頭取腦，在冰冷DHank's里分離雙側(cè)海馬，剪成約1 mm3小塊，用0.25%濃度的胰蛋白酶37℃ 消化15 min，加基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止消化，機(jī)械吹打分散細(xì)胞，400目篩網(wǎng)過濾，制成單細(xì)胞懸液，1 000 r·min－1室溫離心10 min，去上清液，加完全培養(yǎng)基，吹打分散細(xì)胞后制成4×108個(gè)·L－1的單細(xì)胞懸液，接種在預(yù)先包被有PLL的24孔或96孔培養(yǎng)扳內(nèi)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)，通以95%空氣、5%CO2，37℃飽和濕度下培養(yǎng)。培養(yǎng)液中含有90%Neurobasal培養(yǎng)基、10%胎牛血清，2×10－3mol·L－1谷氨酰胺、1 ×105IU·L－1青、鏈霉素。接種48 h后更換培養(yǎng)液，同時(shí)加入1×10－5mol·L－1阿糖胞苷作用48 h，常規(guī)更換培養(yǎng)液。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 取培養(yǎng)12 d的海馬神經(jīng)元，隨機(jī)分為:正常對(duì)照組(僅用Neurobasal完全培養(yǎng)基);SIN-1處理組;SIN-1+氯通道阻斷劑DIDS組。參照實(shí)驗(yàn)［5］SIN-1 的作用濃度是 0.5 mmol·L－1，與氯通道阻斷劑的作用時(shí)間均為18 h。氯通道阻斷劑與SIN-1同時(shí)加入培養(yǎng)基內(nèi)。

1.4 MTT法細(xì)胞存活率的測(cè)定 參照方法［5］，取96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)12 d的海馬神經(jīng)元，加入MTT，終濃度為0.5 g·L－1，37℃下繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去培養(yǎng)液，加入DMSO振蕩10 min，以不加細(xì)胞的培養(yǎng)液空白孔作對(duì)照，酶標(biāo)儀(Bio-tek，USA)檢測(cè)光密度OD。

1.5 Hoechst 33258 DNA熒光染色 參照方法［6－7］，將海馬神經(jīng)元用 0.01 mol·L－1pH 7.4 的PBS沖洗1次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗3次，山羊血清封閉，加 Hoechst 33258(Sigma，St.Louis，MO，USA)(0.25 m/g·L－1)，靜置 15 min，倒置熒光顯微鏡(Olympus，Tokyo，Japan)200倍視野觀察細(xì)胞核的形態(tài)，攝像，隨機(jī)計(jì)數(shù)3個(gè)視野內(nèi)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

1.6 免疫組織化學(xué)熒光對(duì)PARP-1和AIF染色參照方法［8－9］對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行PARP-1和AIF的免疫熒光染色:將海馬神經(jīng)元用0.01 mol·L－1pH 7.4的PBS沖洗1次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗3次，山羊血清封閉，加入一抗抗PARP1(兔抗鼠，Sigma，St.Louis，MO，USA)(1∶800)或抗AIF(兔抗鼠，Sigma，St.Louis，MO，USA)(1 ∶800)，4℃過夜，加熒光標(biāo)記的二抗IgG(羊抗兔，1∶200，武漢，博士德)，30 min后熒光顯微鏡(Olympus，Tokyo，Japan)下觀察，攝像。

1.7 Western blot測(cè)定 Caspase-3、PARP-1和AIF蛋白 取各組海馬神經(jīng)元，參照方法［10－11］處理細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白，用冰冷的0.1mol·L－1PBS洗滌2次→加85℃的上樣緩沖液收集細(xì)胞→SDS-PAGE電泳→PVDF膜轉(zhuǎn)移→3%BSA封閉液封閉，4℃過夜→加兔抗鼠多克隆抗體Caspase-3(1∶5 000)或抗鼠PARP-1(1∶5 000)或抗鼠AIF抗體(1∶5 000)，室溫反應(yīng)2 h→TBS-Trs溶液洗3×10 min→HRP-標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶2 000)室溫反應(yīng)2h→TBS-T洗3次×5min→ECL顯影→壓片曝光。

2 結(jié)果

2.1 DIDS拮抗NO作用的濃度效應(yīng) 0.5 mmol·L－1SIN-1組的細(xì)胞生存率為61.28%，氯通道阻斷劑DIDS對(duì)NO供體SIN-1誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷具有拮抗作用并有濃度依賴性，0.1 mmol·L－1的DIDS對(duì)神經(jīng)元損傷的保護(hù)效應(yīng)比較明顯，與SIN-1組相比差異有顯著性。結(jié)果如Fig 1。

Fig 1 Effects of DIDS on the cultured hippocampal neuronal injury induced by SIN-1(±s，n=6)

2.2 Hoechst 33258染色結(jié)果 正常對(duì)照組神經(jīng)元的核呈藍(lán)色熒光，SIN-1(0.5 mmol·L－1)組大量神經(jīng)元的核呈強(qiáng)亮色熒光并較正常核小，提示核固縮，神經(jīng)元凋亡;SIN-1(0.1 mmol·L－1)+DIDS(0.1 mmol·L－1)組的強(qiáng)亮色熒光明顯減少。如Fig 2。

Fig 2 Effects of DIDS on the cultured hippocampal neuronal apoptosis induced by SIN-1.

2.3 免疫組織化學(xué)熒光染色結(jié)果 免疫熒光染色顯示，抗NeuN抗體呈紅色，抗PARP-1/AIF抗體呈綠色，SIN-1組有明顯的PARP-1/AIF熒光增強(qiáng)，SIN-1+DIDS組的熒光較SIN-1組減弱(Fig 3)。

Fig 3 Immunofluorescent results

2.4 Western blot對(duì)各組 Caspase-3、PARP-1/AIF蛋白檢測(cè)結(jié)果 Western blot結(jié)果顯示:正常培養(yǎng)的神經(jīng)元內(nèi)的Caspase-3很少被激活，蛋白印跡可表現(xiàn)出32 ku肽段條帶，SIN-1處理后的神經(jīng)元內(nèi)有大量的Caspase-3活化的片段17KD和11 ku，氯通道阻斷劑DIDS(0.1 mmol·L－1)能不同程度的減少Caspase-3的激活;PARP-1的活化形式89 ku和AIF(67 ku)在SIN-1+DIDS組明顯弱于SIN-1組(Fig 4)。

Fig 4 Results of Western blot.

3 討論

在缺血性腦損傷中，海馬是最容易損傷的部位，而且缺血后的半暗區(qū)神經(jīng)元的主要損傷方式是凋亡，過量產(chǎn)生的NO是神經(jīng)元凋亡機(jī)制之一［12］。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M缺血性腦損傷的發(fā)生機(jī)制，用SIN-1作為NO供體誘導(dǎo)離體大鼠海馬神經(jīng)元凋亡。SIN-1在水溶液中能釋放出大量NO并形成OONO－自由基產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用［7］。本研究通過分析細(xì)胞生存率和凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的變化，與對(duì)照組相比差異有顯著性，提示SIN-1(0.5 mmol·L－1)誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡模型是成功的。

正常情況下，Caspase-3是32 ku沒有活性的形式存在，凋亡發(fā)生時(shí)，沒有活性的Caspase-3斷裂為有活性的17 ku和11 ku片段，Caspases-3的激活是細(xì)胞遭受各種損傷后Caspase依賴性凋亡信號(hào)通路的執(zhí)行蛋白酶，Caspase-3的抑制可以保護(hù)細(xì)胞免受凋亡的損傷，檢測(cè)該酶的活性狀態(tài)可以作為檢測(cè)細(xì)胞發(fā)生凋亡的指標(biāo)，理論上抑制該酶的活性是抑制凋亡發(fā)生的有效措施［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DIDS(0.1 mmol·L－1)明顯抑制了Caspase-3的激活，提示氯通道阻斷劑可通過Caspase依賴性途徑抑制神經(jīng)元凋亡。目前認(rèn)為，PARP-1/AIF是神經(jīng)元非Caspase依賴性凋亡信號(hào)通路中的靶點(diǎn)分子，PARP-1在正常情況下參與DNA的修復(fù)，過量表達(dá)并激活產(chǎn)生的片段可引起神經(jīng)元的凋亡［13－14］。本研究通過免疫熒光和蛋白電泳檢測(cè)顯示，DIDS能明顯削弱PARP-1/AIF的表達(dá)并能減少PARP-1的活性形式89 ku的形成，提示DIDS的抗凋亡作用可能與此途徑有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，氯通道的活動(dòng)可能參與了NO供體SIN-1誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡過程，在這一過程中，氯通道的活動(dòng)通過什么機(jī)制抑制了凋亡通路中信號(hào)蛋白的表達(dá)有待于進(jìn)一步研究。揭示氯通道在神經(jīng)元凋亡中的作用，將為凋亡的發(fā)生機(jī)制從離子通道方面提供新的理論，為臨床腦缺血性腦損傷的治療和靶點(diǎn)藥物的探索提供實(shí)驗(yàn)和理論參考。

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