鐵皮石斛多糖對RAW264.7細胞分泌TNF-α的影響

蔡海蘭，黃曉君，聶少平，田 芳，謝明勇，崔武衛，3

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌 330047;2.云南金九地生物科技有限公司，云南昆明650033;3.加拿大農業與農業食品部圭爾夫食品研究中心，安大略爾夫NIG5C9)

鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo.)是蘭科石斛屬多年生草本植物，始載于《神農本草經》，具有“主傷中;除痹，下氣;補五臟虛勞羸瘦，強陰。久服厚腸胃;輕身延年”的作用。以新鮮或干燥莖入藥，云南、貴州、浙江、安徽、江西、湖南等地均有分布。古語有云:“北有人參，南有楓斗”，鐵皮石斛由于其獨特的藥用價值，2010年版《中華人民共和國藥典》中作為單獨一味中藥從近百種石斛屬植物中突顯出來，建立起自己明確的專屬性標準。鐵皮石斛化學成分多樣，主要有生物堿、多糖、菲類、聯芐類、香豆素類、花青素等化合物［1－2］，關于鐵皮石斛多糖的研究，國內外主要集中在多糖的提取方法和結構解析上［3－4］，對鐵皮石斛多糖的藥理研究較少，已有部分報道證明鐵皮石斛多糖具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調節［5－7］等作用。本文將以小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞為研究對象，研究鐵皮石斛多糖對RAW264.7細胞活性、腫瘤壞死因子TNF-α的分泌、TNF-α mRNA的表達及核轉錄因子NF-κB的影響［8］，旨在闡述鐵皮石斛多糖免疫調節作用的可能機制，為充分開發應用鐵皮石斛提供參考依據。

1 材料

1.1 細胞 小鼠巨噬細胞株RAW264.7購自上海細胞所，培養于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養液中(含 100 mg·L－1青霉素，100 mg·L－1鏈霉素)，置于37℃，5%CO2細胞培養箱中，每天換液，隔2 d傳代1次。

1.2 試劑 RPMI 1640培養基(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，脂多糖(LPS)(美國Sigma公司)，TNF-α ELISA 試劑盒(武漢博士德公司)，TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒(美國Fermenta公司)，PCR試劑盒(北京全式金公司)，細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒(南京凱基公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學發光試劑盒(北京碧云天公司)，β-actin小鼠單克隆抗體、HRP標記山羊抗鼠IgG二抗、HRP標記的羊抗兔IgG二抗(北京中杉公司)，I-κB兔多單克隆抗體(美國CST公司)。

1.3 鐵皮石斛多糖 來源為云南鐵皮石斛干燥莖(云南金九地生物科技有限公司提供)，經水提醇沉后得到粗多糖(polysaccharides from Dendrobium officinale，DOP)。經硫酸苯酚法檢測其糖含量為75%，凱氏定氮法測定蛋白含量為9% 。DOP溶于一定量細胞培養液中，過濾除菌，－20℃分裝保存。

1.4 儀器與設備 3K15-高速冷凍離心機(德國Sigma公司)，HH-4數顯恒溫水浴鍋(深圳國華電器有限公司)，METTLER TOLEDO AL104電子天平(梅特勒－托利多儀器有限公司)，CO2培養箱、E-330酶標儀(美國 Thermo公司)，超凈工作臺(吳江市凈化設備總廠)，倒置顯微鏡(日本 Olympus公司)，PCR儀、凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 MTT法檢測細胞活性 采用MTT法檢測DOP對RAW264.7細胞的增殖作用。取對數生長期的RAW264.7細胞，以5×104/孔接種于96孔細胞培養板中，分別加入不同體積的鐵皮石斛多糖，補充培養液至200 μl，使多糖終濃度為20，40，80，160 mg·L－1;同時設LPS組(終濃度為1 mg·L－1)。在5%CO2、37℃培養箱中培養24 h后，吸去培養液，每孔加入20 μl MTT，上述條件下繼續培養4 h，棄上清，每孔加入150 μl DMSO，振蕩器上震蕩10 min，酶標儀570 nm波長檢測吸光值，計算細胞相對增殖率。

2.2 ELISA法檢測細胞分泌TNF-α 取對數生長期的RAW264.7細胞1×105/孔接種于96孔細胞培養板中，實驗處理同“2.1”項，24 h后取上清液測定TNF-α含量。每實驗組6個復孔，重復3次。采用ELISA試劑盒，具體操作方法參照試劑盒說明書進行，450 nm處測定吸光度。

2.3 RT-PCR檢測細胞表達TNF-α mRNA調整細胞濃度為1×106/孔接種于6孔培養板，每孔1 ml，于5%CO2，37 ℃培養箱中培養24 h，實驗處理同“2.1”項，培養 24 h，TRIzol試劑盒提取RAW264.7細胞RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。TNF-α引物上游序列:5'-CTTCAGCCCCAG CAGTGTATTCTTT-3'，下游序列:5'AGAGAACCTGGGAGTAGACAAGGTA-3'，擴增產物為 692 bp;β-actin上游序列:5'-CACCACACCTTCTACAATGAGCTGC-3'，下游序列:5'-GCTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT-3'，擴增產物為153 bp。PCR條件為 94℃ ×30 s，60 ℃ ×30 s，72 ℃ ×2 min，29 個循環擴增。得到的擴增產物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，Quantity One軟件分析。

2.4 Western blot檢測細胞中I-κBα蛋白表達收集空白組、DOP 處理組(80，160 mg·L－1)、LPS組(1 mg·L－1)細胞，按胞質蛋白提取試劑盒要求提取蛋白。BCA法檢測蛋白濃度。加入SDS-蛋白上樣緩沖液，水浴煮沸5 min變性，－80℃保存。在10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中進行電泳，每孔蛋白上樣量30 μg。50 V電泳30 min，至指示劑到濃縮膠與分離膠交界處，改為100 V電泳至溴酚藍到凝膠底部，停止電泳。置硝酸纖維膜，放入電轉槽中進行電轉移(60 V，120 min)。移膜至含封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床搖動封閉1 h。加一抗孵育4℃過夜。洗滌后加二抗，室溫孵育1 h后，再次洗滌。用ECL檢測液發光顯影定影，Quantity One軟件分析。

3 結果

3.1 DOP對RAW264.7細胞的活性影響 MTT實驗結果(Tab 1)顯示，DOP可促進RAW264.7細胞的增殖，且在 20、40、80 mg·L－1劑量范圍內與對照組相比，差異具有統計學意義(P＜0.01)，高劑量(160 mg·L－1)的DOP細胞增殖率下降，但仍可促進細胞增殖，表明DOP無細胞毒作用。

Tab 1 Effects of DOP on cell proliferation in RAW264.7 cells by MTT assay(±s，n=6)

Tab 1 Effects of DOP on cell proliferation in RAW264.7 cells by MTT assay(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs normal control

Group Dose/mg·L－1Proliferation rate/%Normal control 0 0.00 ±0.004 Positive control(LPS)1 18.90 ±0.089＊＊DOP 10 10.17 ±0.101 20 18.29 ±0.173＊＊40 15.10 ±0.134＊＊80 14.28 ±0.146＊＊160 8.94 ±0.141

3.2 DOP對 RAW264.7細胞分泌TNF-α的影響

ELISA檢測結果(Tab 2)顯示，DOP能刺激小鼠巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子TNF-α，并隨著DOP劑量的增加，TNF-α的分泌量逐漸升高，與空白組相比，20、40、80、160 mg·L－1處理組差異均具有顯著性。

Tab 2 Effects of DOP on TNF-α production in RAW264.7 cells(±s，n=6)

Tab 2 Effects of DOP on TNF-α production in RAW264.7 cells(±s，n=6)

*P＜0.05;＊＊P＜0.01 vs normal control

Group Dose/mg·L －1 TNF-α/ng·L －1 Normal control 25.64 ±0.003 Positive control(LPS)1 84.00 ±0.015＊＊DOP 20 31.25 ±0.032*40 33.63 ±0.075＊＊80 36.46 ±0.013＊＊160 47.72 ±0.06＊＊

3.3 DOP對RAW264.7細胞TNF-α mRNA表達的影響 在“3.2”中發現DOP可以劑量依賴性增加小鼠巨噬細胞TNF-α的分泌量，但是不清楚這種分泌量的增加是否在轉錄水平調控，故對TNF-α mRNA進行半定量實驗，結果如Fig 1所示。在未受刺激的狀態下，TNF-α mRNA少量表達，LPS處理后，TNF-α mRNA表達量明顯增加。DOP處理組隨著DOP濃度的增加，TNF-α mRNA的表達量也呈增加趨勢，160 mg·L－1劑量下達到最大值。說明DOP促進TNF-α的分泌可能是通過增加TNF-α mRNA表達量來調控。

Fig 1 Effects of DOP on the expression of mRNA of TNF-α

3.4 DOP對RAW264.7細胞I-κBα蛋白表達的影響 在“3.2”、“3.3”研究的基礎上，本實驗以80、160 mg·L－1為 DOP 的作用濃度。DOP 作用于RAW264.7細胞24 h后收集細胞，胞質蛋白提取試劑盒提取蛋白，Western blot檢測胞質內 I-κBα水平，結果如Fig 2所示。DOP作用于RAW264.7細胞后，樣品內參β-actin蛋白量表達基本不變的情況下，DOP能劑量依賴性降低RAW264.7細胞胞質內I-κBα 水平。

Fig 2 I-κB expression by DOP-stimulated RAW264.7 cells

4 討論

巨噬細胞是免疫效應細胞，具有多種免疫功能，包括免疫防御、免疫監視、免疫調節等，在機體的先天性免疫系統中發揮重要作用［9］。TNF-α是活化的巨噬細胞殺滅病原微生物及腫瘤細胞的主要效應分子，可通過上調巨噬細胞MHCⅡ類分子，提高其抗原遞呈能力;還可提高中性粒細胞的吞噬能力，增強超氧陰離子產生，增強ADCC(抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)功能，刺激細胞脫顆粒和分泌髓過氧化物酶;活化NK細胞發揮細胞毒作用。由于巨噬細胞分泌的TNF-α在抗腫瘤，提高免疫力等方面有獨特的作用，已激起人們極大的興趣去發現調節TNF-α 的免疫治療劑［10－11］。研究表明 NF-κB 的特異性性抑制劑PDTC(Pyrrolidine Dithiocarbamate)可以抑制 TNF-α 的表達［12］，說明 NF-κB 參與 TNF-α轉錄水平的調控。在靜止細胞中，NF-κB抑制蛋白(I-κB)與 NF-κB p65 蛋白結合，覆蓋 p50 核定位信號，使NF-κB以一種非活化的形式存在于胞質中。巨噬細胞激活后可促使I-κBα磷酸化降解，從而使NF-κB轉位進入細胞核，隨著 NF-κB的激活，一系列在免疫反應和炎癥反應中發揮重要作用的炎癥因子、趨化因子的基因表達也相應被激活，如IL-1β、IL-6、NO 等，細胞周期調控蛋白 D、E［13］。

本實驗研究發現DOP作用于細胞后，細胞生長狀態良好，在所用劑量范圍內，MTT測定證實其無細胞毒性。通過檢測 DOP作用后 RAW264.7的TNF-α分泌增加，證實了DOP具有促TNF-α分泌的作用。與此同時，DOP增加TNF-α mRNA表達和I-κBα蛋白表達。研究結果提示，DOP增加TNF-α的分泌可能歸結于兩個原因:(1)DOP直接在轉錄水平調節TNF-α mRNA的表達;(2)DOP通過抑制I-κBα 的表達，破壞了 I-κBα-NF-κB 復合物導致核轉錄因子NF-κB的激活，從而調控TNF-α mRNA的表達。因此，DOP誘導的TNF-α的明顯分泌可說明其具有增強免疫的功能。在臨床上，可作為癌癥治療的免疫輔助藥物來緩解抗癌藥物的副作用，這也解釋了為何鐵皮石斛自古以來以其獨特的藥用價值被人們奉為九大仙草之首，其中發揮免疫增強活性的有效成分可能是DOP。但是，由于多糖分子量較大，可能主要通過細胞表面多糖特異性受體發揮調節作用［15］，因而關于DOP發揮免疫調節活性的具體作用機制如信號通路等仍需要進一步研究。

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