碳酸酐酶抑制劑甲苯磺烷唑胺血漿蛋白結合的特征

王金達，石永平，潘志遠，崔文玉，張雁芳，汪 海

(1.軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所，北京 100850;2.北京賽德維康醫藥研究院，北京 100039)

高原低氧等因素引起的急性高原反應是對高原工作者和進入高原人群的健康的極大的威脅。碳酸酐酶抑制劑醋氮酰胺是美國FDA批準正式用于防治急性高原反應的藥物，但其不良反應發生率高，嚴重影響人體的作業能力［1］。甲苯磺烷唑胺(P-8)是擁有自主知識產權的新型化學結構碳酸酐酶抑制劑，研究發現它可以抑制碳酸酐酶Ⅱ的活性，明顯提高小鼠耐低氧能力，其效價和效能均優于醋氮酰胺［2］。

藥物血漿蛋白結合率是藥物代謝動力學的重要參數之一，本實驗采用平衡透析法考察了甲苯磺烷唑胺大鼠和人的血漿蛋白結合率，為進一步開展甲苯磺烷唑胺的藥動學研究提供參考，并為臨床合理設計甲苯磺烷唑胺給藥方案提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 戴安高效液相色譜儀及色譜工作站(戴安公司，美國);BP211D型分析天平(Sartorius);TDX-1型漩渦混合器 (通達科技);BF-2000M型氮氣吹干儀(八方世紀);恒溫培養箱(Forma ScientificⅡ，Forma);透析袋(D25mm，截留范圍8000-14000，進口分裝)。

1.2 藥品與試劑 甲苯磺烷唑胺(自制，純度＞98%);非那西丁(Sigma試劑公司，純度＞98%);甲醇(色譜純，安徽時聯特種溶劑有限公司);冰醋酸、碳酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉均為分析純;水為millipore去離子水;人血漿由中國人民解放軍307醫院提供。

1.3 動物 Wistar大鼠，♀♂各半，180～220 g，購自軍事醫學科學院實驗動物中心，合格證號:SCXK-(軍)2007-004。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱為Zorbax Eclipse Plus C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);保護住為 Zorbax Eclipse Plus C18(12.5 mm × 4.6 mm，5 μm);流動相為0.1%冰醋酸:甲醇(V∶V)=42∶58;柱溫為25℃;流速為1 ml·min－1;檢測波長為285 nm;進樣量為20 μl。

2.2 樣品處理

2.2.1 透析內液 取大鼠或人血漿樣品150 μl于1.5 ml的離心管中，加入10 mg·L－1非那西丁溶液(內標)20 μl，渦旋振蕩器上振蕩30 s后，加入二氯甲烷1 ml，渦旋振蕩器上振蕩3 min。4 000 r·min－1離心5 min，移去上層液體，取下層溶液40℃氮氣揮干。殘渣用流動相復溶至50 μl，10 000 r·min－1離心 5 min，取上清，進樣 20 μl于高效液相色譜儀測定。

2.2.2 透析外液 取透析外液300 μl于1.5 ml的離心管中，加入內標溶液 10 μl，其余操作同“2.2.1”項下血漿樣品的處理。

2.3 血漿蛋白結合率的測定［3－4］將長約10 cm的透析袋一端結扎，加入2 ml空白血漿，將其另一端扎緊后，懸浮于盛有20 ml含藥緩沖溶液［5］的廣口瓶中，并將其放置于37℃的恒溫培養箱中使其平衡。透析結束后，分別測定透析袋內血漿藥物濃度和透析外液中藥物濃度，計算藥物的血漿蛋白結合率，并用10%(V/V)高氯酸溶液檢查透析外液有無蛋白漏出，棄掉漏出者。

Fig 1 HPLC chromatograms of P-8

3 結果

3.1 專屬性 在本實驗條件下，甲苯磺烷唑胺出峰時間為15 min左右，內標出峰時間為5.5 min左右，空白透析液和空白血漿中均無雜峰干擾，甲苯磺烷唑胺和內標都能達到良好分離(Fig 1)。

3.2 線性關系

3.3.1 透析內液 精密稱取甲苯磺烷唑胺10.0 mg于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得標準貯備液，并用甲醇稀釋成濃度不同的標準系列溶液。取空白大鼠或人血漿150 μl，分別加入5 μl不同濃度的標準系列溶液，按“2.2.1”項下方法處理樣品，進樣檢測。以甲苯磺烷唑胺峰面積與內標峰面積的比值對質量濃度進行線性回歸，得回歸方程見Tab 1。

3.2.2 透析外液 取空白透析液300 μl，分別加入10 μl不同濃度標準系列溶液按“2.2.2”項下方法處理樣品，其余同透析內液。回歸方程見Tab 1。

Tab 1 Standard curves of P-8

3.3 精密度、準確度及提取回收率 按“3.2”項下方法配制低、中、高3個濃度的模擬血漿樣品和模擬透析液樣品，按各樣品處理方法考察精密度、準確度及提取回收率，結果見Tab 2。

Tab 2 Accuracy，precision and recovery of P-8

3.4 穩定性 分別考察“3.3”項下模擬生物樣品于－20℃凍藏1周，反復凍融2次，殘渣4℃放置2 d和預處理后室溫放置24 h的穩定性。此外，考察了含藥透析液在37℃恒溫培養箱中放置24 h的穩定性。結果，各個濃度樣品在上述條件下比較穩定。

3.5 透析膜的吸附考察［5］將含有2 ml空白透析液的透析袋懸浮于盛有20 ml含藥透析液的廣口瓶中，37℃放置24 h后測定袋外的藥物濃度，考察透析膜對藥物的吸附。結果，低、中、高3個濃度下吸附率分別為1.70%、7.01%和8.82%，表明透析膜對藥物有微量吸附，但其對測試結果的影響可以忽略。

Tab 3 Plasma protein binding rates of P-8

3.6 血漿蛋白結合率的測定 按照“2.3”項下方法操作，考察3個濃度下甲苯磺烷唑胺的血漿蛋白結合率，每個濃度3個樣本，分別于不同時間點結束實驗，考察透析平衡時間。結果見Tab 3，甲苯磺烷唑胺在24 h時在大鼠或人血漿中透析已達到平衡，大鼠和人的平均血漿蛋白結合率分別為(96.03±0.10)%和(94.24±0.52)%。

通過SPSS 13.0軟件對24 h的數據做統計分析，比較各濃度組間血漿蛋白結合率的差異以及甲苯磺烷唑胺與大鼠和人血漿蛋白結合率的差異。結果表明，各濃度組間大鼠和人血漿蛋白結合率差異均無顯著性(P＞0.05)，即甲苯磺烷唑胺的血漿蛋白結合率無濃度依賴性;甲苯磺烷唑胺與大鼠和人血漿蛋白結合率有種屬差異性(P＜0.05)，大鼠血漿蛋白結合率高于人血漿蛋白結合率。

4 討論

血漿蛋白結合率的測定是新藥臨床前研究的重要內容之一，藥物在體內與血漿蛋白的結合是一個動態平衡過程，血漿中只有游離型藥物才能產生藥效。此外，游離型藥物的濃度與藥物的毒理學過程也密切相關。因此，藥物的蛋白結合率研究具有重要意義。

首先建立了甲苯磺烷唑胺血漿樣品的HPLC分析方法，該方法快速、簡便、選擇性強，準確度、精密度均符合生物樣品分析方法的要求。平衡透析法是研究藥物血漿蛋白結合率的經典方法，與其他方法相比，具有原理簡單，操作方便，成本較低的優點。我們采用平衡透析法對甲苯磺烷唑胺大鼠和人的血漿蛋白結合率進行了比較研究，結果表明甲苯磺烷唑胺與大鼠和人的血漿蛋白都有較強的結合(血漿蛋白結合率＞90%)，無濃度依賴性，說明在0.1～0.5 mg·L－1范圍內，甲苯磺烷唑胺與血漿蛋白的結合未達到飽和;甲苯磺烷唑胺與大鼠和人血漿蛋白結合率有種屬差異性，大鼠血漿蛋白結合率高于人血漿蛋白結合率。

綜上，本研究首次建立了甲苯磺烷唑胺生物樣品的測定方法，并對甲苯磺烷唑胺大鼠和人血漿蛋白結合率進行了比較研究，這將為下一步臨床前藥代動力學研究奠定基礎。甲苯磺烷唑胺的血漿蛋白結合率很高，提示當其與其它高蛋白結合率的藥物同時應用于臨床時，我們應該注意它們與血漿蛋白結合的競爭作用。

［1］ 汪 海.職業性高原病藥物治療學［M］.北京:軍事醫學科學出版社，2010:303 －6.

［1］ Wang H.Drug therapeutics of occupational plateau disease［M］.Beijing:Military Medical Science Press，2010:303 －6.

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