慢性嗎啡處理對C6細胞EAAT3蛋白表達的影響及其機制研究

吳 強，何惠燕，傅艷妮，劉 玲，曹銘輝

(中山大學孫逸仙紀念醫院1.麻醉科、2.消毒供應中心，廣東廣州 510120)

嗎啡依賴的機制非常復雜，關聯到許多調控因素，其中谷氨酸能神經遞質系統發揮了重要作用［1］。細胞外液缺乏谷氨酸(glutamate，Glu)失活的水解酶系統，神經末梢釋放的谷氨酸需要神經元和膠質細胞上的谷氨酸轉運體重攝取至胞內，從而消除谷氨酸能的信號傳遞作用。興奮性氨基酸轉運蛋白3(excitatory amino-acid transporter 3，EAAT3)是神經元特異性的，在調控Glu攝取速度及Glu受體的功能、調節γ-氨基丁酸(GABA)的濃度、保護神經元方面均發揮重要作用［2－3］。我們前期的研究發現嗎啡精神依賴及復吸大鼠前額葉皮層EAAT3蛋白表達水平下降［4］，但其機制未明。本研究使用C6細胞體外模擬嗎啡成癮、戒斷、復吸過程，探討嗎啡暴露對C6細胞EAAT3蛋白表達水平的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料試劑 大鼠C6膠質瘤細胞株(購于中山大學動物中心);鹽酸嗎啡注射液(沈陽第一制藥公司，批號:000355);多克隆兔抗EAAT3(Alpha Diagnostic International，USA);β-actin 抗體(Amersham，Sweden);HRP標記山羊抗兔IgG二抗(Amersham，Sweden);HRP標記的羊抗小鼠二抗(Amersham，Sweden)。

1.2 細胞培養 使用含10%新生牛血清和100 KU·L－1青－鏈霉素的DMEM培養液培養C6細胞，置于37℃、含5%CO2的細胞培養箱中培養。分組后，分別按每孔2 ml、108個·L－1細胞濃度，種于6孔板上。分別加入不同濃度的嗎啡處理細胞，使得C6細胞在提取蛋白前，細胞間有80% ～100%融合。

1.3 實驗步驟 ① 培養好的C6細胞分為5組:Control、0.01、0.1、1 、10 μmol·L－1組，分別使用0、0.01、0.1、1、10 μmol·L－1嗎啡作用48 h，Western blot檢測EAAT3蛋白表達水平，選擇對EAAT3蛋白表達影響最明顯的濃度用于下一步的細胞復吸模型。② 將 C6細胞分為 4組:Control、24、48、96 h組，各組嗎啡作用時間分別為0、24、48、96 h，作用濃度為步驟①選擇的嗎啡最佳暴露濃度，Western blot檢測EAAT3蛋白表達水平，選擇對EAAT3蛋白表達影響最明顯的暴露時間用于下一步的復吸模型。③ 將 C6細胞分為6組:Control、Mor 48 h、Ex 3 h、Ex 6 h、Ex 12 h、Ex 24 h組。使用步驟①和步驟②選擇的最佳暴露濃度和最佳暴露時間處理細胞，然后用不含嗎啡的培養液培養細胞模擬嗎啡戒斷過程。具體用藥如下:Control組為不加藥物組，Mor 48 h 組為 10 μmol·L－1嗎啡作用 48 h，Ex 3 h、Ex 6 h、Ex 12 h、Ex 24 h 組分別為 10 μmol·L－1嗎啡作用48 h 后停藥3、6、12、24 h。Western blot檢測 EAAT3蛋白表達水平，選擇最佳戒斷時間用于下一步的復吸模型。④ 將細胞分為6組:Control、Mor 48 h、Ex 12 h、Re 2、Re 4、Re 8 h 組。C6 細胞依次經過嗎啡暴露、戒斷、再次暴露(嗎啡劑量為第1次給藥的1/2)，Western blot檢測嗎啡多次暴露對EAAT3蛋白表達變化的影響，模擬嗎啡復吸過程。具體用藥如下:Control組為不加藥物;Mor 48 h組 10 μmol·L－1嗎啡，作用時間為 48 h;Ex12 h 組為 10 μmol·L－1嗎啡預處理48 h 停藥12 h;Re 2、Re 4、Re 8 h 組分別為 10 μmol·L－1嗎啡預處理 48 h、停藥12 h 后復處理2、4、8 h。⑤ 將細胞分為4組:Control、Mor(嗎啡)、NAL(納洛酮)、NAL+Mor(納洛酮加嗎啡)組。Control組為不加藥組，Mor組為 10 μmol·L－1嗎啡預處理 48 h、、停藥12 h 后5 μmol·L－1嗎啡復處理4 h，NAL+Mor組在嗎啡再次暴露前15min使用非選擇性阿片受體阻滯劑納洛酮(1 μmol·L－1)，其余處理同Mor組。NAL組只使用納洛酮(1μmol·L－1)。觀察在嗎啡重新暴露前15min使用納洛酮對EAAT3蛋白表達變化的影響。

1.4 Western blot步驟 用冰冷的PBS洗細胞3次，加適量細胞裂解液裂解細胞，用細胞刮匙將細胞刮下來，超聲破碎細胞。混勻細胞5s。細胞液于4℃以12 000×g速度離心30 min，轉移上清液于新的EP管中。BCA法測定樣品的蛋白含量，用10%SDS－聚丙酰胺凝膠分離蛋白，30 μg/well樣品蛋白100 V電泳90 min。然后將蛋白轉移到NC膜，轉膜電壓為100 V，時間1 h。5% 的脫脂奶粉溶液于封閉1 h，多克隆兔抗EAAT3(1∶2 000)4℃孵育過夜，TBST緩沖液沖洗3次，辣根過氧化物酶標二抗，室溫孵育1 h，TBST緩沖液沖洗3次，ECL曝光，高敏感X線片顯色。用program Image J(version 1.35)進行相對灰度值分析。

2 結果

2.1 不同濃度嗎啡作用于C6細胞48 h對C6細胞EAAT3蛋白水平的影響 0.01、0.1、1、10 μmol

·L－1嗎啡分別作用于C6細胞48 h，Western blot結果示 10 μmol·L－1組 C6 細胞 EAAT3 蛋白表達明顯較對Control組減少(P＜0.05)，見Fig 1。

Fig 1 Effects of different concentrations of morphine on the expression of EAAT3 in C6 cells(n=4)

2.2 10 μmol·L-1嗎啡作用不同時間對C6細胞EAAT3蛋白表達水平的影響 10 μmol·L－1嗎啡分別作用于C6細胞24、48、96 h后，免疫印跡法檢測結果顯示作用時間為48、96 h時EAAT3蛋白表達水平較Control組均明顯減少(P＜0.05)，見Fig 2。

Fig 2 Effects of 10 μmol·L-1morphine with different action time on the expression of EAAT3 in C6 cells(n=4)

2.3 嗎啡作用于C6細胞誘導EAAT3蛋白表達下調后停藥不同時間EAAT3表達回升的時間依賴性10 μmol·L－1嗎啡作用于 C6 細胞48 h 后 EAAT3蛋白表達較 Control組明顯減少(P＜0.05)，停藥12、24 h時 EAAT3蛋白表達水平較嗎啡作用48 h組明顯增加(P＜0.05)，與Control組相比差異無統計學意義(P＞0.05)，見Fig 3。

2.4 嗎啡預處理C6細胞停藥后、復處理C6細胞不同時間EAAT3表達改變的時間依賴性 10 μmol·L－1嗎啡預處理 C6 細胞48 h、及復處理2、4、8 h EAAT3蛋白表達均減少，其中復處理4、8 h時較Control組明顯減少(P＜0.05)，見 Fig 4。

2.5 納洛酮對慢性嗎啡暴露戒斷后重新暴露C6細胞EAAT3蛋白表達的影響 C6細胞依次經過慢性嗎啡暴露48 h、戒斷12 h、重新暴露4 h后EAAT3蛋白表達較Control組明顯下降(P＜0.05);在嗎啡重新暴露前15 min使用非選擇性阿片受體阻滯劑納洛酮(1 μmol·L－1)與嗎啡共同作用4 h后可明顯抑制嗎啡重新暴露引起的EAAT3表達下降(P＜0.05)。與Control組相比，僅使用非選擇性阿片受體阻滯劑納洛酮對EAAT3蛋白表達水平無明顯影響(P＞0.05)，見Fig 5。

Fig 3 Effects of different extinction time after 10 μmol·L-1 morphine treated for 48 h on the expression of EAAT3 in C6 cells(n=4)

Fig 4 Effects of retreatment for different time after 10 μmol·L-1 morphine pretreated on the expression of EAAT3 in C6 cells(n=4)

3 討論

C6膠質瘤細胞可內生性地表達EAAT3和多種阿片受體［5－6］，常被用作研究EAAT3表達水平調控機制的工具細胞。本研究使用C6細胞依次經過嗎啡暴露、停藥、小劑量嗎啡再次暴露的過程，模擬嗎啡成癮、戒斷、復吸的行為，探討EAAT3蛋白表達水平改變參與嗎啡成癮及復吸的可能機制。我們的結果發現，10 μmol·L－1嗎啡首次暴露48 h 可明顯下調C6細胞EAAT3蛋白表達，至少停用嗎啡12 h EAAT3蛋白表達回升至正常水平，C6細胞再次暴露于5 μmol·L－1嗎啡作用4 h即可引起 EAAT3蛋白表達明顯減少。本研究提示C6細胞EAAT3蛋白表達水平在嗎啡暴露后呈時間依賴性變化，而且二次嗎啡暴露時EAAT3蛋白表達下降所需嗎啡劑量減少、暴露時間縮短。

Fig 5 Effects of naloxone on the expression of EAAT3 in C6 cells treated by chronic morphine exposure，abstinence and reexposure(n=4)

CPP建立－消退－復燃模型是目前常用的研究藥物復吸的動物模型［7］。一般 5 ～10 mg·kg－1嗎啡腹腔注射訓練7－10 d可建立CPP模型，標志藥物精神依賴的形成。而CPP已消退的實驗動物只需2.5 mg·kg－1嗎啡腹腔注射，15 min后進行行為學測試CPP即可復燃［8］。本研究使用C6細胞二次嗎啡暴露時嗎啡劑量減小、暴露時間明顯縮短，與動物成癮復吸模型的嗎啡暴露條件一致。同時我們還發現C6細胞EAAT3的蛋白表達水平在嗎啡二次暴露后仍呈現明顯的時間依賴性改變，提示嗎啡反復使用引起的成癮或復吸可明顯下調EAAT3的蛋白表達，暴露次數越多，EAAT3的蛋白表達下調的速度越快。這說明其蛋白表達水平改變可能是嗎啡反復使用而導致成癮后復吸的重要機制之一。

EAAT3是神經元上主要的氨基酸轉運體，其表達水平降低必然影響其清除突觸間隙興奮性氨基酸的功能。大量的實驗證明嗎啡耐受及依賴后谷氨酸失衡，如海洛因誘發的復吸模型中發現伏核核心部Glu的含量增加。同時研究表明，中樞神經系統Glu遞質系統及其受體的激活可以通過增加NAc的多巴胺(DA)釋放強化中樞興奮劑等藥物的獎賞效應，促進藥物濫用，而阻斷內源性Glu的分泌可抑制嗎啡誘導的腹側被蓋區中DA釋放的增加、拮抗嗎啡的獎賞效應，抑制嗎啡CPP的形成［9］。而作為唯一快速有效清除谷氨酸的轉運蛋白的表達或功能改變必將影響細胞的生理功能而導致神經系統的病變。我們的結果提示嗎啡反復給藥對谷氨酸重攝取能力的影響，是通過改變了谷氨酸轉運蛋白的表達來實現的。與我們的研究結果類似，其他實驗室的研究結果也證實谷氨酸轉運能力明顯影響嗎啡耐受及依賴。Nakagawa等［10］發現谷氨酸轉運蛋白的激動劑MS-153可以抑制嗎啡的成癮。嗎啡慢性處理后，脊髓內EAAT3和GLAST的表達下降［11］。雖然在嗎啡成癮形成中不同的谷氨酸轉運體其改變及作用不盡相同。但總體上而言，加強谷氨酸轉運體功能往往可延緩嗎啡耐受及依賴的形成。因此，開發可用于臨床的谷氨酸轉運體增強劑，可能會為嗎啡成癮后復吸的防治帶來希望。

關于慢性嗎啡處理C6細胞EAAT3表達下降的機制，有報道顯示［5］EAAT3表達下調為轉錄后調節，1 μmol·L－1納洛酮作用 48 h 可逆轉 10 μmol·L－1嗎啡誘導的EAAT3表達下降，提示嗎啡是通過作用于阿片受體，啟動細胞內多種信號通路降低EAAT3表達。而我們研究發現C6細胞在嗎啡二次暴露前15 min使用1 μmol·L－1納洛酮4h即可逆轉嗎啡二次暴露引起的EAAT3表達下降，提示阿片受體在嗎啡多次暴露引起的神經元可塑性中起重要作用。關于各種阿片受體在調控嗎啡誘導EAAT3表達改變中的具體作用目前少有報道。動物實驗證實，μ受體在嗎啡誘導的CPP行為和自身給藥行為過程中起主要作用，δ受體對其起調節作用［12］。因C6細胞表達μ受體較多，δ受體數量較少［6］。推測嗎啡誘導的C6細胞EAAT3表達下降可能主要通過μ受體起作用。但δ受體是目前報道的唯一對皮層神經元由Glu引起的傷害有保護作用的阿片受體［13］，δ受體激活及表達對EAAT3清除谷氨酸的能力具有調節作用。因此各種阿片受體對氨基酸轉運蛋白的調控作用將有待進一步研究。

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