蚤休薯蕷皂苷對內(nèi)皮細胞的保護作用涉及TLR4/NF-κB途徑

高琳琳，李福榮，姚樹桐，桑 慧，司艷紅，焦 鵬，秦樹存

(泰山醫(yī)學院1.病理生理學教研室，2.藥物化學教研室，3.動脈粥樣硬化研究所，山東 泰安 271000)

動脈粥樣硬化(atherosderosis，AS)是一種復雜的多因素疾病，內(nèi)皮細胞功能障礙是AS形成的早期病變，內(nèi)皮細胞損傷、炎癥機制在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中起著極為重要的作用［1］。最近研究表明，非感染性甚至感染性因素引起的炎癥反應和免疫系統(tǒng)的活化貫穿于AS的始終［2］。

近年研究表明介導先天免疫和炎癥反應的受體Toll樣受體4(TLR4)參與了 AS的發(fā)生和發(fā)展。TLR4與特異性自身配體結合后，通過髓樣分化因子88(MyD88)依賴性或非依賴性信號轉導途徑激活下游一系列蛋白級聯(lián)反應，將刺激信號轉導至細胞核內(nèi)，導致細胞核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、活化蛋白-1、干擾素調(diào)節(jié)因子等重要免疫基因轉錄因子的活化，最終激發(fā)一系列針對不同病原微生物的免疫事件［3］，而TLR4信號轉導通路在AS發(fā)生和發(fā)展中的機制尚不明確。

本課題組前期實驗中發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)抗蛇毒藥物蚤休能夠減輕高脂血癥大鼠動脈內(nèi)皮細胞損傷，減少內(nèi)皮細胞合成和釋放內(nèi)皮素以及抗H2O2誘導的凋亡［4－6］，具有減輕動脈內(nèi)皮細胞氧化損傷和抑制主動脈中膜平滑肌增殖的功效，從而具有防治AS和高血壓病的作用。為了進一步探討蚤休對內(nèi)皮細胞氧化損傷的保護機制，深入研究中醫(yī)藥對TLR4及其下游信號轉導通路的生物學特性及其調(diào)控機制的影響，從細胞和分子水平開展前瞻性的實驗研究，本實驗應用流式細胞儀PI染色、激光共聚焦顯微鏡JC-1染色及Western blot檢測ox-LDL損傷前后對臍靜脈內(nèi)皮細胞細胞周期、線粒體電位、TLR4和NF-κB蛋白的表達的影響，旨在進一步探討蚤休成分對細胞氧化損傷保護作用的機制及其相關信號轉導通路。

1 材料與試劑

1.1 材料 蚤休薯蕷皂苷(Rhizome Dioscin，RD)由天津馬克生物技術有限公司提供，人臍靜脈內(nèi)皮細胞株(HUVEC)與JC-1熒光染料購自南京凱基生物公司，兔抗人TLR4、NF-κB多克隆抗體購自武漢博士德公司，二抗羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司，PI染液、JC-1染色試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 ox-LDL的制備和鑒定［7］采用序列超速離心法分離健康人新鮮血漿低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)，經(jīng)瓊脂糖電泳、十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳均顯示為單一蛋白條帶。提純的LDL用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的PBS液透析48 h，隨后在含 10 μmol·L－1CuSO4的 PBS 液(pH 7.2)中37℃溫育透析12 h，最后在含100 μmol·L－1EDTA的 PBS中4℃透析24 h。過濾除菌，BCA試劑定量蛋白，用 PBS調(diào)蛋白濃度至1 g·L－1，4℃保存?zhèn)溆?。取氧化前后?LDL，測定硫代巴比妥酸反應物質(zhì)丙二醛(malondialdehyde，MDA)的濃度，并采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定ox-LDL的形成。

1.3 細胞培養(yǎng)及干預 將人臍靜脈內(nèi)皮細胞株(HUVEC)在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，以含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度，按每瓶2 ml接種于25 ml的細胞培養(yǎng)瓶，每48 h更換培養(yǎng)液1次。待細胞融合率為70% ～80%時，無血清培養(yǎng)12 h后使細胞同步化于G0期，然后按分組分別加藥進行預處理24 h。細胞分組如下:正常對照組:不加任何藥物的培養(yǎng)基;氧化損傷組:ox-LDL終濃度為100 mg·L－1;RD高、中、低劑量預處理組:(1 mg·L－1、100 μg·L－1、10 μg·L－1)，加藥預處理后加入ox-LDL，作用12 h。

2 方法

2.1 流式細胞儀PI染色分析各實驗組細胞周期變化 37℃溫箱取出各處理組細胞培養(yǎng)瓶，胰蛋白酶消化，分別收集細胞放入試管中。將試管以1 000 r·min－1離心 5 min，棄上清液，加入 4℃ PBS，渦旋方式混勻，再離心，洗滌細胞2次。將4℃ 70%的乙醇約0.5 ml貼壁緩慢加入試管中，固定細胞。以1 800 r·min－1離心細胞懸浮液5 min，傾去固定液。再加PBS離心洗滌細胞1次。每毫升106細胞加入500 U的RNA酶，使終濃度為50 mg·L－1，37℃保溫30 min。離心去除RNA酶，再經(jīng)PBS洗1次，去上清液。每106細胞加50 mg·L－1的 PI 1 ml，室溫下避光染色20 min以后，300目尼龍網(wǎng)過濾。上流式細胞儀測定(激發(fā)波長488 nm，氫離子激光)，用multcycleDNA分析軟件包進行細胞周期分析。

2.2 JC-1染色檢測線粒體膜電位 蓋玻片培養(yǎng)細胞于6孔板，藥物處理結束，PBS洗滌，加入500 μl JC-1工作液，培養(yǎng)箱中孵育15～20 min，孵育液洗滌，取出蓋玻片于熒光顯微鏡下觀察拍照。當膜電位水平較高時，JC-1主要以聚合體形式存在，呈紅色熒光，當膜電位水平較低時，主要以單體形式存在，呈綠色熒光。通過Image ProPlus圖像分析軟件測定細胞內(nèi)的紅色和綠色熒光強度，相對定量線粒體膜電位水平。

2.3 Western blot法檢測蛋白的表達 細胞接種于25 mm培養(yǎng)瓶內(nèi)，在各處理因素作用后，預冷的PBS洗2次，加入 65 μl細胞裂解液，4℃靜置30 min，1 200 r·min－1離心 10 min，取上清，BCA 法進行蛋白定量。總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，隨后加入1∶1 000稀釋的兔抗人的抗體，輕搖過夜，用TBST洗3次，加入相應的二抗，室溫孵育1 h，漂洗3次，ECL顯色后，用Image軟件進行灰度分析。

3 結果

3.1 實驗各組藥物對細胞周期的影響 各實驗組DNA倍體分析圖可見，損傷組G0/G1期細胞比例明顯高于對照組、S期細胞百分比低于對照組(P＜0.01)，而RD各濃度組預處理后，G0/G1期細胞比例低于對照組、S期細胞百分比明顯高于對照組(P＜0.05或P＜0.01)，見流式細胞儀PI染色DNA倍體分析結果(Fig 1、2)。

Fig 1 Effect of RD on cell cycle of HUVEC observed by flow cytometry A:Normal control;B:injured group;C:10 μg·L－1RD;D:100 μg· L－1 RD;E:1 mg·L－1RD

3.2 激光共聚焦顯微鏡JC-1染色檢測細胞線粒體跨膜電位(ΔΨm)的變化 與正常對照組相比，ox-LDL損傷組紅色熒光強度減弱而呈現(xiàn)較為鮮亮的綠色，顯示線粒體對JC-1攝取量下降，表明ox-LDL引起線粒體跨膜電位降低，導致電位去極化的發(fā)生。RD預處理24 h的HUVEC，同陰性對照組相比膜電位升高，細胞著色逐漸向紅色過渡，見Fig 3。

3.3 實驗各組TLR4和NF-κB表達的變化 結果表明，經(jīng)ox-LDL誘導，TLR4和NF-κB的表達增多，而RD各組均可抑制TLR4和NF-κB的表達 其中RD低劑量組與ox-LDL損傷組各指標相差不明顯，RD中高劑量組較損傷組則有明顯差異，見Fig 4、5。

Fig 2 Ratio of cell cycle distribution of RD of HUVEC observed by flow cytometry

Fig 3 Effect of RD on mitochondrial membrane potential(ΔΨm)of HUVEC observed by laser scanning confocal microscope

4 討論

蚤休為百合科多年生草本植物蚤休及其同屬植物的根莖，藥用歷史悠久，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效，是著名的中成藥“云南白藥”的成分之一。常用于治療癰腫、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、驚風抽搐等。蚤休化學成分復雜，主要包括有甾體、脂肪酸酯、黃酮類及多糖。蚤休主要有效成分是甾體皂苷，文獻報道及本課題組前期實驗均證實皂苷有較強的抗氧化和抗炎癥損傷的藥理活性。

Fig 4 Effect of RD on TLR4 expression in protein level of HUVEC by Western blot

Fig 5 Effect of RD on NF-κB expression in protein level of HUVEC by Western blot

目前動脈粥樣硬化(AS)被認為是一種在發(fā)病起始和整個過程中都伴有免疫反應的慢性炎癥性疾病過程，大量流行病學臨床病理學和動物模型的研究均提示，TLR4在AS的發(fā)生、發(fā)展中起著重大作用。TLR4通過激活天然免疫，參與特異性免疫應答的啟動，促進炎癥的發(fā)展，在AS中發(fā)揮了重要作用。同時在AS發(fā)展過程中血管平滑肌細胞(VSMC)發(fā)生增殖、遷移，并分泌細胞因子、趨化因子、蛋白酶等，促進 AS的發(fā)生、發(fā)展。此外，TLR4與VSMC之間存在一定的相互作用，對AS的不同階段產(chǎn)生影響。

研究發(fā)現(xiàn) ，與正常血管相比，AS病變中的TLR4表達明顯增加。體外培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細胞在基礎條件下TLR4表達很低，但經(jīng)促炎因子刺激，TLR4表達明顯升高［8］。此外，在早期AS病變中血管平滑肌細胞遷移至內(nèi)膜下轉變?yōu)榕菽毎?，在此過程中血管中層平滑肌細胞中TLR4表達上調(diào)。而ox-LDL等TLR4內(nèi)源性配體與TLR4結合后，致使TLR4的表達增加以及 TLR4信號轉導途徑激活［9］。Edfeldt等［10］在AS的斑塊中發(fā)現(xiàn)TLR4的表達明顯提高，并證實正是通過 TLR4的識別功能導致一系列與AS有關的細胞因子的合成與釋放TLR4激活所生成的炎癥因子 IL-6、IL-1和TNF-α等能刺激血管平滑肌細胞的遷移及增殖。

JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential)ΔΨm的理想熒光探針。可以檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以產(chǎn)生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC-1為單體(monomer)，可以產(chǎn)生綠色熒光。線粒體電位去極化導致熒光染料的攝入量下降是大多數(shù)細胞凋亡的早期事件，其發(fā)生意味著線粒體功能發(fā)生損傷［11］。本研究結果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組細胞著色為亮紅色不同，ox-LDL可導致HUVEC的線粒體膜電位下降，細胞呈現(xiàn)鮮亮的綠色，而RD處理后，隨著藥物濃度增加逐漸向紅色過渡，因此RD能夠抑制ox-LDL誘導的ΔΨm下降。

本研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL氧化損傷的HUVEC的TLR4的表達明顯增加，且這種增加可能與其血漿中ox-LDL等修飾脂蛋白增加有關，實驗結果表明，RD作用后，HUVEC的氧化凋亡下降，細胞周期阻滯解除，線粒體膜電位恢復，表現(xiàn)為S期細胞比率增加，JC-1染色顯示線粒體膜電位呈濃度依賴性明顯升高，且TLR4及其下游信號轉導途徑中的NF-κB表達明顯減弱，這提示RD具有抑制ox-LDL誘導的HUVEC發(fā)生凋亡的作用，其機制可能部分與TLR4/NF-κB信號轉導途徑的激活、穩(wěn)定線粒體膜電位、保護線粒體功能、從而抑制內(nèi)皮細胞凋亡有關。TLR4信號轉導途徑在AS發(fā)生當中有著重要作用，該信號途徑的激活至少是 AS發(fā)生當中的一個重要環(huán)節(jié)［10］，通過對 TLR4及其下游信號轉導途徑在AS發(fā)生、發(fā)展中所起作用的認識，有助于人們找到治療AS性疾病新的治療策略。因此，開發(fā)靶點特異、高效的TLR4拮抗藥物，可望為AS的中醫(yī)藥治療及其機制研究提供新的切入點。結合本實驗研究結果提示，RD是一種具有多方位內(nèi)皮保護效應的藥物，在抑制 TLR4/NF-κB途徑的激活，阻斷內(nèi)皮細胞氧化損傷、細胞周期阻滯，繼而阻斷AS的發(fā)生發(fā)展，尤其是預防上具有潛在的應用價值。至于RD對蛋白表達調(diào)控具體的信號轉導機制還有待進一步研究。

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