光譜法研究野漆樹苷與人血清蛋白的結合作用

鄧少東，帥 歐，林 勵，肖鳳霞，卓嘉琳

(廣州中醫藥大學中藥學院，廣東廣州 510006)

血清蛋白(SA)是血液中重要的運輸蛋白，藥物進入機體后首先與血清蛋白結合，通過血漿的存儲和運輸，到達受體部位產生藥理作用，是藥物發揮藥效的重要載體和靶分子。SA在紫外光激發下，分子具有較強的內源熒光發射，也可與多種內源和外源性物質結合而使其熒光光譜有所變化［1］。探討具有藥理活性的小分子與SA的作用機制，對闡明藥物在體內的分布與代謝過程以及了解藥物發揮藥效的作用機制有重要意義［2-3］。

野漆樹苷為化橘紅、山香圓葉等中藥中的黃酮類活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗登革熱及促進胰島素受體磷酸化等作用［4-6］。近年，關于野漆樹苷的研究越來越多，已被收錄為2010年版中國藥典一部山香圓葉及其制劑山香圓片的含量測定用對照品［7］，但迄今未見野漆樹苷與人血清蛋白(HSA)之間相互作用的報道，為此作者開展了本項研究，以期為野漆樹苷在臨床上合理應用提供理論參考。

1 材料

1.1 儀器 F-2500型熒光分光光度計(日本HITACHI);CARY-50型紫外 -可見分光光度計(美國 VARIAN);BP211D型電子天平(德國Sartorius公司);DKB-501A型超級恒溫水槽(上海森信實驗儀器有限公司);Genpure超純水系統(德國TKA公司);PHB-3型PH計(上海三信儀表廠)。

1.2 試藥 野漆樹苷(自制，純度99.32%)，精密稱取適量溶于50%甲醇/水中，配制成濃度為2.576 mmol·L-1的溶液;Tris-鹽酸緩沖液(上海雙螺旋生物科技，批號K0810A)，精密量取適量加入超純水，稀釋成50 mmol·L-1(pH 7.4)的緩沖液;HSA(廣州威佳科技，純度95%，批號70024-90-7)，精密稱取適量用上述緩沖液配制成0.01036 mmol·L-1的溶液;實驗用水均為超純水。

2 方法

2.1 光譜掃描 在220～800 nm范圍內，測定HSA溶液的激發光譜和發射光譜，得Ex=280 nm，Em=336 nm。在5 ml具塞試管中，各加入1.9ml HSA溶液，分別加入0.0、8.0、16.0、24.0、32.0、40.0、48.0、56.0、64.0、72.0、80.0、88.0、96.0 μl的野漆樹苷溶液，用移液槍加Tris-鹽酸緩沖液至2.00 ml，將溫度分別調至 25℃、37℃，激發和發射光譜狹縫寬度均為5.0 nm，進行熒光光譜掃描，記錄野漆樹苷對HSA的熒光猝滅光譜圖，同時記錄Δλ=15 nm與 Δλ=60 nm的同步熒光光譜;紫外-可見分光光度計測定與 HSA相同濃度的野漆樹苷在290～500 nm范圍內的紫外吸收光譜。

2.2 猝滅機制確定及猝滅常數的計算 根據Stern-Volmer方程和Lineweaver-Burk雙倒數方程判斷野漆樹苷的熒光猝滅機制［8］。

Stern-Volmer方程:

Lineweaver-Burk雙倒數方程:

式中F0、F分別為未加和加入猝滅劑時HSA的熒光強度。Kq為雙分子猝滅速率常數，［Q］為猝滅劑的濃度，τ0為不存在猝滅劑時熒光分子平均壽命(約為10-8s)，KSV為動態猝滅常數，Ka為靜態猝滅常數，n為結合位點數。

2.3 結合距離的測定 根據 Foster能量轉移原理［9］，當化合物滿足以下條件時會發生非輻射能量轉移:供能體發射熒光;供能體熒光發射光譜與受能體吸收光譜有足夠的重疊;供能體與受能體之間的結合距離不超過7 nm。

能量轉移效率E與結合距離r之間的關系:

E為能量轉移效率，R0為能量轉移效率為50%時的臨界距離，r為供能體與受能體之間的距離，F為HSA濃度與藥物濃度為1∶1時HSA的熒光強度，K2為供能體-受能體偶極空間取向因子，N為介質的折射指數，Φ為HSA的熒光量子產率，J為供能體的發射光譜與受能體的吸收光譜的重疊積分。

其中，Fλ是供能體在波長λ處的熒光強度，ελ是受能體在波長λ處的摩爾吸光系數，Δλ為計算時分割的波長跨度。根據HSA熒光發射光譜與野漆樹苷吸收光譜的疊加圖，把光譜重疊部分分割成很小的矩形，依據式(5)求得野漆樹苷與 HSA的重疊積分，將 J值及 K2、n、Ф值代入式(4)，即可求出臨界距離 R0，計算中 K2、n、Ф 分別取 2/3、1.336、0.118。能量轉移效率E可由E=1-F/F0求出，最后得出HSA與野漆樹苷之間的結合距離。

2.4 作用力類型的確定 有機小分子和HSA之間的結合力主要包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等［10］。根據反應前后熱力學參數焓變(ΔH)和熵變(ΔS)的相對大小，可以判斷小分子與蛋白質間的主要作用力類型，ΔH＞0、ΔS＞0為典型的疏水作用力;ΔH＜0、ΔS＜0為氫鍵和范德華力;ΔH＜0、ΔS＞0為靜電作用力。根據熱力學關系式，計算野漆樹苷與HSA相互作用的熱力學參數，從而判斷作用力類型。K1、K2分別為在T1、T2溫度下野漆樹苷與 HSA的結合常數，R為氣體常數約等于8.314。

2.5 同步熒光光譜的測定 固定HSA濃度為1×10-5mol·L-1，改變野漆樹苷濃度測定△λ分別為15 nm和60 nm的同步熒光光譜。

3 結果

3.1 野漆樹苷對HSA熒光光譜的影響 HSA的熒光光譜能反映HSA分子中氨基酸殘基所處微環境及其分布情況、蛋白質高級結構［11］。Fig 1顯示:隨著加入野漆樹苷濃度的增加，336 nm處HSA的最大熒光發射峰逐漸降低。野漆樹苷僅引起HSA內在熒光有規律的猝滅，并未出現明顯的發射波長紅移、藍移或峰形改變。

3.2 野漆樹苷對HSA內在熒光猝滅的機制探討 以F0/F對［Q］作圖(Fig 2)得 KSV與 Kq，以 lg［(F0-F)/F］對 lg［Q］作圖(Fig 3)，得出藥物與HSA的結合常數Ka和結合位點數n。根據 KSV與Ka隨溫度的變化可以對猝滅機制進行判斷［12］。對于動態猝滅，溫度升高有利于猝滅過程進行，KSV隨溫度的升高而增大;而靜態猝滅，溫度升高形成的復合物穩定性降低，Ka隨溫度的升高而減小。由Tab 1發現，野漆樹苷的Ka都隨溫度升高而降低，Kq值均遠大于各類猝滅劑對生物大分子的最大動態猝滅速率常數2.0×1010L·mol-1·s-1［13］，表明野漆樹苷對 HSA的熒光猝滅作用主要是其分子與HSA的Trp殘基結合形成了某種特定結構的超分子復合物所引起的靜態猝滅。

Fig 1 Effect of rhoifolin on fluorescence spectra of HSA at 37℃

3.3 野漆樹苷與HSA的結合距離 根據HSA熒光發射光譜與野漆樹苷吸收光譜的疊加圖(Fig 4)，計算得出 HSA與野漆樹苷之間的結合距離為4.16 nm，小于7 nm。說明HSA(供能體)與野漆樹苷(受能體)之間發生非輻射能量轉移，推測其對HSA內在熒光的猝滅可能是通過分子間的能量轉移而引起的。

3.4 野漆樹苷與HSA的作用力類型 根據熱力學公式，計算野漆樹苷與HSA相互作用的熱力學參數，見Tab 2。由Tab 2可知，野漆樹苷與HSA的互相作用是氫鍵和范德華力結合為主的自發過程。

3.5 野漆樹苷對 HSA同步熒光光譜的影響 △λ=15 nm和△λ=60 nm的同步熒光光譜分別顯示酪氨酸殘基和色氨酸殘基特征［14］。芳香氨基酸殘基的最大發射波長與其所處環境極性有關，由發射波長的改變可判斷 HSA中芳香氨基酸殘基所處微環境的變化。最大發射波長紅移，表明芳香氨基酸殘基所處微環境的疏水性降低，極性增強;藍移則表明微環境的疏水性增強，極性降低。

Tab 1 Fitting parameters of the interaction between HSA and rhoifolin at different temperature

同步熒光光譜(Fig 5)測定結果表明酪氨酸殘基和色氨酸殘基的特征熒光光譜峰均隨野漆樹苷濃度的增加而產生猝滅，野漆樹苷的色氨酸殘基和酪氨酸殘基光譜最大發射波長基本沒變，表明對應的HSA中色氨酸殘基和酪氨酸殘基附近的微環境并未改變。

Fig 2 Stern-Volmer plots of the interaction between HSA and rhoifolin

Fig 3 Lineweaver-Burk plots of the interaction between HSA and rhoifolin

Fig 4 Overlap of absorption of rhoifolin with HSA fluorescence spectra

Tab 2 Thermodynamic parameters of interaction between HSA and rhoifolin

4 討論

本實驗采用光譜法研究了模擬生理條件下野漆樹苷與HSA的相互作用。結果表明，靜態猝滅是導致野漆樹苷對HSA熒光猝滅的主要原因，兩者互相作用以氫鍵和范德華力結合為主。與HSA的結合距離表明了HSA(供能體)與野漆樹苷(受能體)之間可發生非輻射能量轉移，它們對HSA內在熒光的猝滅可能是通過分子間的能量轉移而引起的。

野漆樹苷與HSA的同步熒光實驗表明:野漆樹苷的色氨酸殘基和酪氨酸殘基光譜最大發射波長基本沒變，推測是由于它們的結合常數較小，不利于與ⅡA區域結合，從而未使蛋白質中色氨酸殘基和酪氨酸殘基的構象發生變化。隨著野漆樹苷的加入發現色氨酸殘基熒光猝滅程度比酪氨酸殘基熒光猝滅程度更為明顯，表明HSA的熒光主要由色氨酸殘基所貢獻，野漆樹苷與HSA結合位點更接近于色氨酸殘基。

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