哮喘患兒血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因多態(tài)性的初步研究

陳 新 周 林 鐘威達(dá)

海南省婦產(chǎn)科醫(yī)院兒科，海南 海口 570105

哮喘是一種嚴(yán)重危害小兒身體健康的常見(jiàn)呼吸道疾病，其發(fā)病率較高、病程較長(zhǎng)且反復(fù)發(fā)作[1]。研究表明，兒童哮喘是遺傳和環(huán)境因素共同作用的多基因遺傳性疾病，故與哮喘的相關(guān)或易感基因的多態(tài)性越來(lái)越受到重視[2]。本研究通過(guò)檢測(cè)哮喘患兒血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）基因型及其分布，探討ACE多態(tài)性和兒童哮喘的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2009年6月～2010年7月我院兒科收治的87例哮喘患兒為實(shí)驗(yàn)組，其中，男43例，女44例；年齡3～9歲，中位年齡6歲；診斷按全國(guó)兒科防治協(xié)作組制定的兒童哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]進(jìn)行。本院健康體檢合格兒童58例為對(duì)照組，其中，男32例，女26例；年齡3～10歲，中位年齡6歲；對(duì)照組兒童均無(wú)哮喘病史及哮喘家族史，無(wú)食物和藥物過(guò)敏史。兩組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 ACE基因型檢測(cè)方法

所有病例采集靜脈血2 mL，使用Axygene全血基因組DNA抽提試劑盒（批號(hào)：QC30061104）抽提基因組DNA；ACE的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司，其正向引物序列為5'-CTGGAGACCACTCCCA-3'，反向引物序列為 5'-GATGTGGCCATCACATTCGCAGAT-3'，PCR 反應(yīng)體系包括基因組 DNA 2 μL、10×PCR buffer 5 μL、dNTP 25 mmol/L 3 μL、Taq DNA 聚合酶0.5 μL （2.5 U），MgCl23 μL（25 mmol/L），正向引物 1 μL、反向引物 1 μL、加水至 50 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 10 min、94℃ 45 s、58℃ 45 s、72℃ 90 s，30 個(gè)循環(huán)周期，72℃延長(zhǎng) 10 min。取反應(yīng)產(chǎn)物5 μL加上樣緩沖液1 μL，在2%的瓊脂糖凝膠電泳30 min，在紫外燈下觀察結(jié)果并且攝影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACE基因型結(jié)果判定

PCR產(chǎn)物的僅有長(zhǎng)度為190 bp的條帶，說(shuō)明該產(chǎn)物287 bp插入片段缺失，其基因型為缺失型純合子DD型；PCR產(chǎn)物僅有長(zhǎng)度為490 bp的條帶，表明該產(chǎn)物中存在287 bp的插入片段，其基因型為插入型純合子II型，PCR產(chǎn)物有190 bp、490 bp兩條條帶，該產(chǎn)物的基因型為雜合子ID型，見(jiàn)圖1。

圖1 ACE基因型檢測(cè)圖例

2.2 兩組ACE各基因型頻率和等位基因頻率比較

實(shí)驗(yàn)組中，38例基因型為缺失型純合子DD型，19例基因型為雜合子ID型，30例基因型為插入型純合子II型；在對(duì)照組中，9例基因型為缺失型純合子DD型，18例基因型為雜合子ID型，31例基因型為插入型純合子II型；將兩組基因型進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組三種基因型的構(gòu)成差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.64，P＜0.05），見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)組等位基因D和I頻率依次為54.59%和45.41%，對(duì)照組等位基因D和I頻率依次為31.03%和68.97%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.60，P ＜ 0.05），見(jiàn)表 2。

表1 哮喘患兒ACE基因型檢測(cè)結(jié)果[n（%）]

表2 哮喘患兒ACE等位基因頻率[n（%）]

3 討論

在腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）或腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）中，血漿中的腎素底物（即血管緊張素原），在腎素的作用下水解，產(chǎn)生一個(gè)十肽，為血管緊張素Ⅰ。血管緊張素Ⅰ本身沒(méi)有生物學(xué)活性，但在肺循環(huán)血管內(nèi)皮表面的ACE的作用下，血管緊張素Ⅰ水解為有活性的血管緊張素Ⅱ。研究發(fā)現(xiàn)，在哮喘發(fā)作時(shí)，其腎素和血管緊張素Ⅱ在血漿內(nèi)的濃度明顯升高[4]。血管緊張素Ⅱ在哮喘中的作用主要表現(xiàn)在以下2個(gè)方面[5]：首先血管緊張素Ⅱ能夠?qū)е潞粑榔交∈湛s，引發(fā)哮喘的發(fā)作；其次，血管緊張素Ⅱ能夠激活炎癥因子如緩激肽、P物質(zhì)等炎癥因子，加快哮喘的發(fā)生和發(fā)展。

ACE基因全長(zhǎng)21 kb，由26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子組成[6]。目前對(duì)ACE的基因多態(tài)性的研究表明，ACE第16個(gè)內(nèi)含子中可以存在一段287 bp插入片段（insertion，I），也有個(gè)體缺失此片段（deletion，D），根據(jù)個(gè)體等位基因是否存在這一插入片段，ACE基因存在著DD，ID和II三種基因型[7]。研究表明，由于不同基因型，ACE的活性并不相同，DD型的ACE活性最強(qiáng)，ID型次之，II型最弱[8]。

筆者對(duì)ACE基因型檢測(cè)結(jié)果表明，哮喘患兒缺失型純合子（DD基因型）的比例明顯高于正常兒童，哮喘患兒的D等位基因頻率明顯的高于正常兒童，因此推測(cè)ACE基因型為缺失型純合子的兒童可能更加容易發(fā)生哮喘，這也提示ACE基因中是否存在插入片段可能和哮喘的發(fā)生有關(guān)。國(guó)外對(duì)成人ACE多態(tài)性和哮喘之間的研究也同樣表明，ACE基因型為缺失型純合子發(fā)生哮喘的可能性更高[4]。

[1]Picconatto WJ，Ross SK，Carlson AM.Athletes and asthma [J].Minn Med，2010，93（12）：33-36.

[2]Zhang Y，Tian C，Zhang J，et al.The-159C/T polymorphism in the CD14 gene and the risk of asthma：a meta-analysis[J].Immunogenetics，2011，63（1）：23-32.

[3]何云，謝曉虹，鄧昱，等.哮喘兒童吸入丙酸氟替卡松后外周血單個(gè)核細(xì)胞Foxp3和磷酸化STAT5的變化[J].臨床兒科雜志：英文版，2011，29（1）：1-7.

[4]Prieto MC，Gonzalez-Villalobos RA，Botros FT，et al.Reciprocal changes in renal ACE/ANG II and ACE2/ANG 1-7 are associated with enhanced collecting duct renin in Goldblatt hypertensive rats[J].Am J Physiol Renal Physiol，2011，300（3）：F749-755.

[5]Eryuksel E，Ceyhan BB，Bircan R，et al.Angiotensin converting enzyme gene polymorphism in Turkish asthmatic patients[J].J Asthma，2009，46（4）：335-338.

[6]Summers CW，Pumphrey RS，Woods CN，et al.Factors predicting anaphylaxis to peanuts and tree nuts in patients referred to a specialist center[J].J Allergy Clin Immunol，2008，121（3）：632-638.

[7]Kim TH，Chang HS，Park SM，et al.Association of angiotensin Ⅰ -converting enzyme gene polymorphisms with aspirin intolerance in asthmatics[J].Clin Exp Allergy，2008，38（11）：1727-1737.

[8]Felehgari V，Rahimi Z，Mozafari H，et al.ACE gene polymorphism and serum ACE activity in Iranians typeⅡ diabetic patients with macroalbuminuria[J].Mol Cell Biochem，2011，346（1-2）：23-30.