白介素-1β在緩激肽開放血腦屏障過程中的作用及其機制

秦麗娟，薛一雪，谷艷婷，張志勇，張 田，孫 娜，王東春，宋鴻艷

(1.中國醫科大學基礎醫學院神經生物學教研室，遼寧沈陽 110001;2.河北聯合大學基礎醫學院生理學教研室，河北唐山063000;3.沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院生理學教研室，遼寧沈陽 110016;4.河北聯合大學附屬醫院神經外科，

5.河北聯合大學附屬唐山工人醫院神經外科，河北唐山 063000;6.赤峰市松山醫院內科，內蒙古赤峰 024005)

化學療法在人體其他部位腫瘤的治療中取得了肯定的效果，但在腦膠質瘤的治療中卻存在著很多問題。最主要的原因在于腦組織中存在血腦屏障，且在腫瘤組織中同樣存在血腫瘤屏障，使得化療藥物不易達到腫瘤部位，從而給臨床上腦膠質瘤的治療帶來了很大困難［1－2］。目前對于膠質瘤的化療主要集中在先將血腦屏障和血腫瘤屏障打開，再將化療藥物注入體內，使化療藥物能夠通過開放的屏障進入腫瘤組織。打開血腦屏障可以用高滲性藥物如甘露醇等，但是經研究發現，這種高滲性藥物雖然可以使血腦屏障開放，但其開放不具選擇性，甚至往往只能開放正常血腦屏障，而對血腫瘤屏障影響不大［3］。最近，國外研究［4－7］發現，將緩激肽 B2 受體激動劑與卡鉑聯合作用于腦組織可選擇性開放血腫瘤屏障，并在臨床Ⅱ期試驗中得到了證實。但有關緩激肽(bradykinin，BK)選擇性開放血腦屏障的確切機制迄今尚不明了。

1 材料與方法

1.1 C6膠質瘤細胞及分組 大鼠惡性膠質瘤細胞株C6由美國UCLA提供。用高糖的DMEM培養基加10%胎牛血清培養C6細胞，37℃孵箱孵育，并通以5%的CO2。至細胞增殖至109·L－1，培養的C6細胞分別于給予緩激肽(1 μmol·L－1)后 10、30、60、120、180和240 min時取培養液2 ml于 EP管，－70℃冰箱保存備測IL-1β含量。細胞用胰酶消化后收集于EP管，－70℃冰箱保存備測HSF1的表達及IL-1β mRNA水平。

1.2 C6細胞培養液內和腦膠質瘤組織內IL-1β含量 用放射免疫法測定C6細胞培養液和腦膠質瘤組織中IL-1β的含量，試劑盒購自北京科美東雅生物技術有限公司。操作方法按照試劑盒內的操作指南進行。

1.3 C6細胞內HSF1蛋白表達及IL-1β mRNA水平測定 采用Western blot法檢測C6細胞內HSF1的蛋白表達(rat monoclonal anti-HSF1購自Neomarkers公司)，RT-PCR法測定C6細胞內IL-1β mRNA水平(試劑盒購自TaKaRa公司)。

1.4 實驗動物及分組 選用Wistar健康♂大鼠，由中國醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號:SCXK(遼)2003-0009，體質量200～220 g，隨機分為:注射 IL-1β 及緩激肽后 10、30、60、120、180和240 min組。

1.5 C6膠質瘤動物模型的建立及血腦屏障通透性測定 收集培養的C6細胞1×105/5 μl通過立體定向儀接種于動物大腦右側尾狀核，約15 d成瘤。

IL-1β處理組:成瘤后的動物以10%水合氯醛(3 ml·kg－1)麻醉后，首先經尾靜脈注射2%的伊文思藍(購自 Fluka公司)2 ml·kg－1，然后用微量輸液泵經右側頸內動脈給予IL-1β(每組動物給藥終濃度為:給予緩激肽后相應時間點C6細胞培養液內IL-1β的增加量)，并分別于給藥后10、30、60、120、180和240 min時斷頭取腦，解剖顯微鏡下去除額極和枕極各2 mm，分離左右半球，稱取左右半球濕重后，按0.1 ml·g－1腦組織加入甲酰胺溶液，60℃孵育24 h。提取液在分光光度計λ=632 nm處測定吸光度值。根據標準曲線計算腦組織伊文思藍含量(μg·g－1wwt)，間接測定血腦屏障通透性。

緩激肽處理組:實驗操作過程同前，緩激肽注射量為 10 μg·kg－1·min－1。

2 結果

2.1 各組C6細胞培養液中IL-1β含量變化 給予緩激肽后，C6細胞培養液中IL-1β含量開始逐漸增加，120 min達高峰，以后又隨時間推移而減少，且給予緩激肽后C6細胞培養液中IL-1β含量較給予生理鹽水(NS)組明顯增加(如Tab 1)。

2.2 C6細胞內IL-1β的mRNA水平 細胞給予緩激肽后，IL-1β的mRNA水平開始升高，60 min達高峰，以后又隨時間推移而逐漸減少(如Fig 1)。

2.3 C6細胞內HSF1的表達 細胞給予緩激肽后，HSF1三聚體的表達于第30 min迅速達高峰，以后隨時間推移而減少，但仍明顯高于對照組(Fig 2)。表明C6細胞在緩激肽作用下，HSF1由無活性的單體形式轉變為有活性的三聚體形式而被激活。

Fig 1 IL-1β mRNA levels of C6 cells after bradykinin treatment(n=15)

Tab 1Contents of IL-1β in the nutrient fluid of C6 cells by BK(μg·L－1，±s，n=15)

Tab 1Contents of IL-1β in the nutrient fluid of C6 cells by BK(μg·L－1，±s，n=15)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 BK group vs NS group

Group Time after BK treatment/min 10 30 60 120 180 240 Concentrations after NS 1.39 ±0.06 1.08 ±0.128 1.54 ±0.12 1.26 ±0.12 1.07 ±0.05 1.38 ±0.09 Concentrations after BK 2.60 ±0.05 5.55 ±0.51* 10.59 ±0.96* 14.49 ±0.78＊＊ 8.71 ±0.84* 6.90 ±0.38*Release values of IL-1β 1.21 ±0.02 4.47 ±0.39 9.05 ±0.66 13.23 ±0.85 7.64 ±0.79 5.52 ±0.28

2.4 緩激肽組與對照組大鼠的腫瘤組織內IL-1β含量 實驗大鼠注射緩激肽后，瘤組織內IL-1β含量開始增加，于120 min時達高峰后開始減少。而對照組動物腦組織內的IL-1β含量未見明顯變化(Fig 3)。

2.5 血腦屏障通透性 動物注射IL-1β及緩激肽后伊文思藍含量增加，且均于120 min時達高峰，其后隨時間推移而減少，但仍高于對照組(Fig 4)，說明緩激肽引起血腦屏障開放程度最大時，腫瘤組織內IL-1β含量也最多。

Fig 2 HSF1 trimer expression in C6 cell after bradykinin treatment(n=15)

Fig 3 IL-1β concentrations of neurospongioma after BK treatment(n=8)

Fig 4 Evans blue concentrations of neurospongioma after BK/IL-1β treatment(n=8)

3 討論

緩激肽是近年發現的可選擇性開放血腦屏障的藥物［8－10］。實驗證實，給RG2腦膠質瘤大鼠頸內動脈注射小劑量緩激肽(10 μg·kg－1·min－1)可選擇性地增加腦腫瘤對示蹤劑(分子質量100～70 000 u)的通透性，且分子越大，作用越強［11］。在臨床觀察中也證實了其選擇性開放血腦屏障的作用［4］，但有關其開放血腦屏障的確切機制目前尚不十分明了。

本研究發現，經頸內動脈小劑量緩慢注射緩激肽，可選擇性增加C6膠質瘤模型大鼠的血腦屏障通透性，且緩激肽作用于培養的C6細胞后，培養液中IL-1β含量增加，于120 min達高峰，這與緩激肽開放血腦屏障峰值相一致。由此推測緩激肽開放血腦屏障可能與緩激肽促進腦膠質瘤細胞釋放IL-1β有關。為此我們又測定了C6大鼠給予緩激肽后腫瘤組織內IL-1β含量，發現腦膠質瘤內IL-1β含量隨給予緩激肽時間的延長而增加，同樣于120 min達高峰，以后又隨時間推移而減少，進一步說明緩激肽開放血腦屏障可能與IL-1β有關，而且很可能是緩激肽通過刺激C6細胞釋放IL-1β所引起。其后我們應用了C6細胞給予緩激肽后培養液中不同時間點的IL-1β濃度來觀察動物模型血腫瘤屏障通透性，發現以最大IL-1β濃度(即給予緩激肽后120 min時培養液的IL-1β增加量)作用于膠質瘤大鼠，其血腫瘤屏障的通透性最大，進一步證實緩激肽開放血腦屏障的機制可能是通過刺激膠質瘤細胞釋放IL-1β所引起的。

有關緩激肽是如何能引起膠質瘤細胞釋放IL-1β的，我們通過查閱文獻發現其可能與HSF1有關。眾所周知，任何應激都會引起機體產生一種保護性蛋白質HSP70，緩激肽作為一種應激刺激同樣會引起體內HSP70的產生。合成HSP70受HSF1的調控，HSF1通過與熱休克元件(HSE)結合并使之發生磷酸化，激活hsp70基因，HSP70表達增多。通過對hsp70和IL-1β基因啟動子同源性調查發現，IL-1β基因啟動子中也含有與hsp70基因上游相同的完整HSE序列。HSF1能特異性結合到IL-1β基因啟動子的“HSE”序列上，且親和力與HSF1對hsp70基因的 HSE 結合類似［12］，HSF1與 IL-1β 基因啟動子的“HSE”序列結合同樣會影響IL-1β基因的表達。因此，我們在實驗研究中觀察了C6細胞在給予緩激肽后的HSF1表達情況，發現給予緩激肽后的C6細胞，其HSF1的表達于30 min達高峰，而IL-1β基因的表達于60 min達高峰，推測這可能是由于緩激肽作為一種應激刺激首先引起HSF1蛋白表達增加，增加的HSF1蛋白再與IL-1β基因啟動子的“HSE”序列結合，從而使IL-1β基因的表達和釋放增多，進而引起血腦屏障開放。

有關緩激肽開放血腦屏障的機制研究正在一步步展開，我們也一直在致力于此方面的研究工作。相信隨著對此方面研究的進一步深入，一定會使緩激肽開放血腦屏障的機制更加明了，從而實現在臨床工作中控制并最終治愈膠質瘤的目的。

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