左旋多巴甲酯對剝奪性弱視貓視皮層17區神經細胞的影響

黎 榮，梁 韜，林 興，張士軍，蔣偉哲，黃仁彬

(廣西醫科大學藥學院，廣西南寧 530021)

弱視對兒童視力影響很大，若不采取及時的治療將會導致終身視力缺陷。國外研究表明神經生長因子在具有調節視覺發育可塑性的作用［2-3］。即刻早期基因c-fos的表達產物FOS蛋白同樣參與了視皮層相關區域神經元功能活動的調控，從而與視覺發育的可塑性密切相關［4-5］。目前國外臨床上多采用左旋多巴治療弱視，文獻報道其已取得了一定效果［6-7］。而新合成的化學物質左旋多巴甲酯(LDME)將應用于弱視治療研究。

本研究采用TUNEL檢測法和免疫組織化學法檢測觀察左旋多巴甲酯(LDME)對剝奪性弱視貓視皮層17區中細胞凋亡情況以及NGF、FOS陽性神經元的形態變化和數量分布的影響，探討左旋多巴甲酯對弱視神經細胞的影響及治療效果，從而為弱視的預防和治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 包埋機:Japan Sakura finetechnical Co.Ltd，4590 Model;低溫高速離心機:德國西門子公司Gel doc 2000;病理組織切片機:Germany Leitz，2235 Model;病理圖像分析儀:Germany Leica Co.Ltd，DMR+550 Model。

1.2 主要試劑 NGF-β蛋白抗體:武漢博士德公司，批號:3574102;FOS蛋白抗體:北京中杉金橋生物技術有限公司，批號:27261;DAB顯色試劑盒:北京中杉金橋生物技術有限公司，批號:673767A;TUNEL檢測試劑盒:德國 Roche公司，批號:110684817910;二抗:上海長島生物技術有限公司，中國;麻醉劑:體積分數為0.25烏拉坦;灌注液:NS;4℃體積分數為0.04多聚甲醛;緩沖液:30 g·L-1，檸檬酸，2 × SSC，0.5 mol·L-1PBS;5 g·L-1多聚賴氨酸。

1.3 實驗動物模型建立 初生家養幼齡貓(2周齡)30只，體質量約300～320 g，♀♂不分，常規檢查雙眼無異常。隨機分為6組(每組5只):左旋多巴甲酯高劑量組(LDMEH)、中劑量組(LDMEM)、低劑量組(LDMEL)、陽性對照組(PC)正常組(NC)、模型組(MC)。除正常組之外，于 4周齡時參照Hubel［1］經典實驗方法對各組幼貓進行的左眼上下瞼縫合建立剝奪性弱視模型，在12周后打開縫合眼并開始結藥。每天灌胃左旋多巴甲酯20，40，80 mg·kg-1，陽性組為左旋多巴 40 mg·kg-1，正常組與模型組為等劑量生理鹽水，每天1次，持續30 d。動物飼養在符合醫學實驗動物環境設施要求的條件中。

1.4 實驗動物的取材 在給藥后d 31時，腹腔注射適量的體積分數為0.25烏拉坦進行深度麻醉，將插管插入左心室后切開右心房形成出路，與此同時用動脈夾夾住下腔靜脈血管，此做法有利于增加清洗腦的灌注流量，接著先快速灌注4℃生理鹽水250 ml，再灌注體積分數為0.04多聚甲醛500 ml。打開頭顱取腦，根據Snider貓立體定向圖譜，分離出對應的視皮層17區，浸入體積分數為0.04的多聚甲醛液中后固定6 h，經常規逐級脫水，二甲苯透明后，浸蠟包埋，切片厚度為6 μm，以上標本全部置于適當的保存，然后進行Nissl染色、TUNEL檢測以及NGF、FOS免疫組織化學實驗。所有染色過程均按照廠家試劑盒使用說明進行。

1.5 統計學處理 細胞胞質呈棕黃色或棕褐色為免疫陽性細胞。每張切片在視皮質Ⅱ/Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ層分別隨機選取不重疊的5個等長度的視野進行計算機顯微圖像分析，計算每個視野中的凋亡細胞表達計數和陽性細胞數，取其平均值后換算成陽性細胞的密度。采用SPSS13.0軟件，對各組凋亡細胞計數比較采用單因素方差分析，組間均數差異的兩兩比較采用LSD-t檢驗以及各組間免疫陽性細胞數比較進行兩樣本t檢驗。

2 結果

2.1 Nissl染色光鏡觀察結果 經Nissl染色后的視皮層神經元的Nissl小體呈深藍色，細胞核淡藍色。低倍鏡下，正常幼貓視皮層的Nissl染色標本上可以區分為4層:分子層(Ⅰ)、外層(Ⅱ/Ⅲ)、顆粒層(Ⅳ)及內層(Ⅴ/Ⅵ )，相應層細胞排列規則，神經細胞形態和染色正常。Nissl染色在于顯示視皮層的基本神經細胞結構，并可作為免疫組織化學分層計數的基礎。見Fig 1。

Fig 1 Structural feature in the visual cortex area 17 in the cats of normal and model control groups(Nissl staining，×400)

2.2 左旋多巴甲酯對剝奪性弱視貓左側視皮層17區中細胞凋亡的影響 在光鏡下觀察到TUNEL陽性細胞呈棕褐色，給藥組視皮層在相同時期內表現出不同劑量下的治療效價。與模型對照組比較，給藥各組的視皮層17區凋亡細胞數量均有不同程度的減少。其中LDMEH表現出明顯的抗凋亡的效果，差異有統計學意義(P＜0.01)。給藥各組都對左側視皮質17區神經細胞有著一定程度的抑制凋亡作用，差異均有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05)。見 Tab 1、Fig 2。

Tab 1 Density of TUNEL positive cells in layers and divisions of the left 17 area of visual cortex in normal and monocular deprivation cats(±s，n=5，cell·mm-2)

Tab 1 Density of TUNEL positive cells in layers and divisions of the left 17 area of visual cortex in normal and monocular deprivation cats(±s，n=5，cell·mm-2)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs NC;#P＜0.05，##P＜0.01 vs MC.(One-Way ANOVA，LSD-t test)

Group Ⅱ/Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ0.000 0.000 0.001 0.001 NC 22±5 18±4 25±7 12±2 MC 236±42＊＊ 190±28＊＊ 278±34* 163±26*PC 64±19# 58±16# 55±11# 46±17#LDMEL 104±30# 91±22 124±33 78±19#LDMEM 59±23# 45±14## 41±16## 39±15#LDMEH 31±8## 23±11## 28±13## 20±6##F 35.673 38.405 39.795 34.763 P

2.3 左旋多巴甲酯對剝奪性弱視貓左側視皮層17區NGF的影響 光鏡下觀察到胞質呈棕褐色為陽性細胞，各組剝奪側視皮層17區中NGF陽性細胞的分布基本相同，表現為計數細胞密度(ND)的不同。與模型對照組比較，LDME給藥組NGF免疫陽性細胞數量在各層有所增加，層間的差異有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05)。與陽性對照組比較，同劑量給藥的LDMEM陽性細胞數多于左旋多巴陽性組，提示LDMEM發揮了較好治療作用，但LDMEM低于LDMEH或正常對照組，差異均未見統計學意義。見 Tab 2、Fig 3。

2.4 左旋多巴甲酯對剝奪性弱視左側貓視皮層17區FOS蛋白的影響 光鏡下觀察到正常幼貓視皮層17區中的FOS陽性細胞為淡棕黃色。模型對照組視皮層17區中FOS陽性細胞表達較少，較正常組其數量明顯降低，差別有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05)。其中LDMEH陽性細胞數量高于模型對照組，差異有統計學意義(P＜0.01)。但與正常對照組比較，LDMEH的FOS免疫陽性細胞數量在各層均少于正常組對照組，兩者間差異無統計學意義。提示它們之間有一定的量效關系。見Tab 3、Fig 4。

3 討論

近年來研究發現，視覺發育敏感期內的可塑性與多種細胞功能調節因子間有密切聯系，其中的神經生長因子(NGF)可促進神經細胞的修復，在視覺發育的可塑性方面有著重要作用［8-9］。

Tab 2Density of expression of NGF positive cells in layers of the left 17 area of visual cortex(±s，n=5，cell·mm-2)

Tab 2Density of expression of NGF positive cells in layers of the left 17 area of visual cortex(±s，n=5，cell·mm-2)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs NC;#P＜0.05，##P＜0.01 vs MC

Group Ⅱ/Ⅲ Ⅳ Ⅴ ⅥNC 418.45±62.38 532.56±48.22 335.87±41.68 423.57±35.61 MC 147.57±45.13＊＊ 185.47±28.63＊＊ 105.78±26.75* 153.24±47.65*PC 246.89±46.74# 348.19±35.28# 181.56±42.53# 232.89±43.76#LDMEL 218.16±42.29# 305.37±34.48# 143.24±51.87 220.28±41.52 LDMEM 252.24±47.35# 350.21±39.86## 208.57±32.45## 245.57±43.37##LDMEH 389.46±45.68## 512.43±36.55## 331.41±28.65## 398.42±35.41#

Tab 3 Density of expression of FOS positive cells in layers of the left 17 area of visual cortex(±s，n=5，cell·mm-2)

Tab 3 Density of expression of FOS positive cells in layers of the left 17 area of visual cortex(±s，n=5，cell·mm-2)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs NC;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs MC

Group Ⅱ/Ⅲ Ⅳ Ⅴ ⅥNC 381.44±41.47 369.44±43.36 285.66±39.58 317.67±36.52 MC 138.78±38.99＊＊ 119.67±25.03＊＊ 84.78±12.76* 98.11±17.46*PC 215.87±36.32# 208.89±36.74# 112.65±41.52# 159.89±23.87#LDMEL 207.31±24.37 198.02±30.26# 98.25±20.87 135.26±21.32 LDMEM 226.89±38.97## 214.26±48.35# 121.46±24.57## 167.68±24.25##LDMEH 357.58±35.46## 325.43±46.65## 268.43±26.65## 296.32±35.34##

Fig 2 Apoptosis index in the visual cortex area 17 (TUNEL staining，×100)

在細胞水平上，經左旋多巴和左旋多巴甲酯治療后，弱視視皮層17區神經細胞愈合恢復正常，表現為Nissl小體數量增加，說明了左旋多巴甲酯能促進神經細胞的修復。在基因水平上，TUNEL法檢測準確反映了弱視發生后視皮層17區神經細胞凋亡時斷裂DNA的形態和生化特征，而在藥物治療后能夠有效減少細胞凋亡的發生，表現為抗細胞凋亡作用。實驗表明在相等或較大的劑量下，左旋多巴甲酯的治療效果高于左旋多巴，其原因為左旋多巴甲酯脂溶性優于左旋多巴，在相同條件下能更多通過血腦屏障，提高腦內dopamine濃度。在視皮層17區中存在著多巴胺通路，它可直接參與關鍵期視皮層的發育，也可介導調節某些關鍵因子的活性，使發生早期類凋亡的視皮層神經元得到恢復或重塑［10-11］。所以推測:給予左旋多巴甲酯治療后，弱視眼視皮層l7區中神經細胞由于dopamine濃度的補足解除了在“廢用”狀態中NGF的活性，促使其自身合成和釋放，進而參與相關的蛋白酶及基因表達調控，恢復神經細胞的可塑性。

Fig 3 NGF expression in visual cortex area 17(immunohistochemical staining，×400)

Fig 4 FOS expression in visual cortex area 17(immunohistochemical staining，×400)

同樣，有研究認為c-fos基因的表達與神經細胞的可塑性相關，而不僅僅將其表達情況視為神經興奮性活動水平［12-13］。c-fos基因產物FOS蛋白進入細胞核，和Jun家族的產物結合形成AP-1轉錄因子，該活性因子與相關DNA序列結合作為大多數基因的啟動子，實行對其它基因的調控后進行神經細胞的重塑［14］。故推測:給予左旋多巴甲酯后弱視眼視皮層l7區相應區域的dopamine含量增多，dopamine直接介導調節N-甲基-天冬氨酸(NMDA)受體的活性，誘導c-fos基因表達，FOS蛋白合成增加后參與該區的生化調控，從而提高神經細胞興奮性和降低其功能閾，恢復視覺功能。

綜上所述，在一定范圍內剝奪性弱視貓接受左旋多巴甲酯治療后，發揮著抗細胞凋亡作用以及重塑了弱視發生后的神經細胞，故左旋多巴甲酯可作為潛在的治療弱視藥物，本研究為其今后臨床應用提供重要的基礎理論。

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