內源性中葉素可減輕血管緊張素Ⅱ誘導的乳鼠心肌細胞肥大

楊靖輝，馬存根，齊永芬，唐朝樞

(1.山西大同大學腦科學研究所，山西大同 037009;2.北京大學醫學部生理系，北京 100083)

多種疾病狀態下，心臟局部中葉素(IMD)的生成、表達會發生明顯改變。文獻報道，自發性高血壓大鼠及腎性高血壓大鼠心臟IMD基因表達增加［1－2］，而離體缺血/再灌注損傷大鼠心臟組織IMD生成則明顯減少［3］。上述結果提示IMD作為一種重要的旁/自分泌因子參與了疾病狀態下心臟功能的調節。心肌肥厚是多種心血管疾病的一種后期病理改變，以心肌細胞肥大和間質成分改變為主的心臟重塑是心肌肥厚的主要表現形式。在體實驗顯示，肥厚的大鼠心臟 IMD 表達增加［4－5］，但在心肌細胞IMD生成表達是否也具有類似的變化，文獻尚未見報道。

本試驗以血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)作用于培養的乳鼠心肌細胞構建肥大模型，觀察心肌細胞肥大過程中IMD及其受體系統生成表達的變化，并探討內源性IMD在心肌肥大過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 新生Wistar大鼠(1～3 d)由北京大學醫學部實驗動物中心提供。大鼠AngⅡ、IMD1-53、CGRP8-37、ADM22-52、兔抗大鼠IMD抗血清及放射免疫測定試劑盒由Phoenix Pharmaceutical Inc(USA)提供。［3H］-Leu、PVDF膜、ECL試劑盒購自Amersham Life Science(England)，總RNA提取試劑盒購自Gibco-BRL(Grand Island，NY)，反轉錄試劑盒購自 Gibco-BRL，Life Technologies，Inc(Gaithersburg，MD)，Real time PCR反應引物購自北京奧科公司。余為市售分析純產品。

1.2 方法

1.2.1 乳鼠心肌細胞的培養 取新生Wistar鼠心臟，去除心房及血管后剪碎心室，以1 mmol·L－1胰酶37℃消化成細胞懸液，過濾，2 000×g離心10 min，用含10%胎牛血清的DMEM培養液重懸浮，差速貼壁90 min后取上清，將細胞懸液接種于培養瓶中，在37℃、5%CO2條件下密閉培養。48 h后換無血清DMEM，培養24 h后將乳鼠心肌細胞隨機分為:① 對照組;② AngⅡ(10－7mol·L－1)孵育組;③AngⅡ +IMD(10－7mol·L－1)組;④ AngⅡ +IMD抗血清(1∶100)組;⑤ AngⅡ+IMD受體阻斷劑組(ADM22-52 或 CGRP8-37，均為 10－6mol·L－1)組。所有試驗細胞經鑒定95%以上為心肌細胞，95%以上為活細胞。

1.2.2 ［3H］-Leu攝入測定 無血清培養24 h后的乳鼠心肌細胞加入不同干預藥物，孵育12 h后，分別加入［3H］-Leu(37 kBq·L－1)繼續孵育24 h，冷PBS液終止反應，并洗兩遍，細胞以10%三氯醋酸4℃孵育20 min，再經95%乙醇沖洗。收集細胞，以0.5 mol·L－1NaOH融解2 h后加入閃爍液，于β液閃儀上測量［3H］放射活性，以cpm/105細胞表示［3H］-Leu的攝入率。

1.2.3 Real time PCR 方法［6］測定乳鼠心肌細胞BNP、IMD、CRLR、RAMP 1、RAMP 2、RAMP 3 mRNA水平 無血清培養24 h后的乳鼠心肌細胞加入不同干預藥物，孵育12 h后，用TRIzol一步法提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA。Real time PCR反應總體積為 20 μl，其中包括定量 PCR 預混合液 10 μl、前向引物和反向引物(20 mmol·L－1)各 1.8 μl、Probe 0.5 μl、產物 cDNA 0.5 μl、其余用無 RNase 水補足。反應條件:95℃ 5 min;95℃ 30 s;57℃ 30 s;72℃ 30 s，40個循環。測定各模板Ct值，通過Ct值以GAPDH為內參，進行相對定量。相關引物和熒光探針列于Tab 1。

1.2.4 放射免疫法測定IMD含量 收集對照組及AngⅡ孵育12 h后的上清液加入0.5 ml的0.1 mol·L－1醋酸，煮沸10 min，10 000 ×g 離心 15 min，取上清液參照IMD放免試劑盒說明書測定IMD含量，并以 μg·L－1表示。

1.2.5 Western blot分析法 無血清培養24 h后的乳鼠心肌細胞分為對照組和AngⅡ孵育組，培養12 h后收集蛋白，取樣本總蛋白30 μg進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度為12%，之后將蛋白轉移到PVDF膜上，在含5%脫脂奶粉的TBS-T緩沖液中，封閉1 h。漂洗后PVDF膜與兔抗大鼠IMD抗體(1∶200)4℃孵育過夜，經漂洗再與羊抗兔IgG二抗(1∶500)室溫孵育1 h，ECL顯色，結果以β-actin標準化。

Tab 1 Primers and fluorescent probes

2 結果

2.1 AngⅡ對乳鼠心肌細胞IMD及其受體系統基因表達的影響 Real-time PCR結果顯示AngⅡ(10－7mol·L－1)孵育 12 h后乳鼠心肌細胞 IMD mRNA表達較對照組降低46%，RAMP 1，RAMP 3 mRNA表達較對照組分別增強49%和135%(均P＜0.01)，CRLR及RAMP 2 mRNA表達較對照組無差異(Fig 1)。

2.2 AngⅡ抑制乳鼠心肌細胞IMD產生和分泌Western blot結果顯示，與對照組相比AngⅡ孵育可降低心肌細胞IMD蛋白表達。同時，放射免疫分析結果顯示，AngⅡ孵育組較對照組心肌細胞培養上清液中IMD含量明顯降低(6.66±0.65 vs 10.62±0.92 μg·L－1)(均 P ＜0.01，Fig 2)。

2.3 IMD及其抗血清對AngⅡ誘導的乳鼠心肌細胞肥大的影響 本實驗以細胞內蛋白合成增加及BNP mRNA表達增強作為心肌細胞肥大指標。以［3H］-Leu參入方法檢測乳鼠心肌細胞蛋白合成的變化，以Real-time PCR方法檢測乳鼠心肌細胞BNP mRNA 表達。結果顯示，AngⅡ(10－7mol·L－1)孵育使乳鼠心肌細胞［3H］-Leu攝入較對照組增加104%(2529±123 vs 1240±53 cpm/105cells，P ＜0.01，Fig 3A)。同時，BNP mRNA表達較對照組增加197%(P＜0.01，Fig 3B)。外源性給以IMD活性片段 IMD1-53(10－7mol·L－1)可明顯抑制 AngⅡ所誘導的［3H］-Leu攝入及BNP mRNA表達增加(P＜0.01)(Fig 3A，B)。

Fig 1 Effects of AngⅡon IMD and its receptor system components mRNA expressions in neonatal cardiomyocytes(±s，n=3)

單獨給以正常兔血清或兔抗大鼠IMD抗血清(1∶100)對靜止的心肌細胞［3H］-Leu參入及BNP mRNA表達均無明顯影響，但以IMD抗血清預孵育可使乳鼠心肌細胞［3H］-Leu參入量較AngⅡ單獨作用組增加69%(P＜0.01，Fig 3A)，BNP mRNA表達較 AngⅡ單獨作用組增加61%(P＜0.01，Fig 3B)。而正常兔血清預孵育則無上述作用。

2.4 IMD受體阻斷劑對AngⅡ誘導的乳鼠心肌細胞肥大的影響 單獨給以IMD受體阻斷劑ADM22-52或CGRP8-37，二者對靜止心肌細胞的［3H］-Leu參入及BNP mRNA表達均無明顯影響，如果以受體阻斷劑預孵育20 min后再給以AngⅡ刺激，ADM22-52和CGRP8-37可使乳鼠心肌細胞［3H］-Leu參入量較AngⅡ單獨作用組分別增加46%和38%(均P＜0.01，Fig 4A)，BNP mRNA 表達較 AngⅡ單獨作用組分別增加44%和45%(均P＜0.01，Fig 4B)。

3 討論

心肌肥大是高血壓、瓣膜病、急性心肌梗死及先天性心臟病等臨床常見疾病的一種并發癥，持續性心肌肥大最終可導致擴張性心肌病、心衰和猝死［7］。同時，心臟具有重要的內分泌功能，能合成和分泌多種循環激素和旁/自分泌物質，參與循環系統的功能、代謝和結構穩態的調節。其中IMD是心臟旁/自分泌的重要物質之一［8－9］。但在離體培養的肥大心肌細胞上IMD及其受體系統生成、表達的變化目前尚未見報道。本工作應用促肥大因子AngⅡ孵育乳鼠心肌細胞構建肥大模型，觀察肥大發生過程中，心肌細胞IMD及其受體系統生成、表達的變化。

Fig 2 AngⅡinhibits the production and secretion of IMD in neonatal cardiomyocytes(±s，n=6)

試驗結果顯示，AngⅡ孵育乳鼠心肌細胞可明顯誘導細胞肥大的發生，表現為心肌細胞［3H］-Leu攝入及BNPmRNA表達增加。該結果與文獻報道一致［10］。進一步檢測肥大心肌細胞IMD及其受體系統生成、表達的變化。結果顯示，肥大的心肌細胞IMD產生、分泌及基因表達均明顯降低。與此不同的是，有文獻報道，在自發性高血壓大鼠和一氧化氮缺乏大鼠肥大的左心室組織，IMD基因表達明顯增加［4－5］。上述差異可能是由于心臟組織中，除心肌細胞外，成纖維細胞、血管內皮細胞、平滑肌細胞均可生成表達IMD，病理狀態下，各種細胞IMD的生成、表達可受到不同形式的調節。因此，在完整心臟與單純心肌細胞上IMD生成、表達則出現不同。

Fig 3 Effects of IMD and prepro-IMD antiserum on AngⅡ-induced myocyte hypertrophic response(±s，n=6)

此外，實驗還證實，在肥大的心肌細胞RAMP 1、RAMP 3 mRNA表達明顯增強，但CRLR及RAMP 2 mRNA表達無明顯變化。CRLR/RAMPs受體系統是CGRP超家族共同的受體系統。已知RAMPs具有3種亞型RAMP 1、RAMP 2和RAMP 3。不同的RAMP與CRLR結合表現為對不同配體具有親和的，不同的受體表型，從而決定了配體的生物學效應。例如，CRLR與RAMP 1共同作用表現為CGRP受體表型，CRLR與 RAMP 2，3共同作用表現為ADM受體表型。而Roh等［11］的實驗證實IMD可作為CRLR/RAMPs復合物的非選擇性配體。本實驗中RAMP 1、RAMP 3基因表達的上調可促進IMD在心肌肥大發生發展過程中生物學效應的發揮。

Fig 4 Effects of the antagonists of IMD receptor on AngⅡ-induced myocyte hypertrophic response(±s，n=6)

實驗還顯示，外源性給予IMD的活性片段IMD1-53可明顯抑制AngⅡ所誘導的心肌細胞肥大。此外，單獨給以IMD抗血清及IMD受體阻斷劑ADM22-52和 CGRP8-37，3者對靜止心肌細胞的［3H］-Leu參入及BNP mRNA表達均無明顯影響，但在給以IMD抗血清阻斷內源性IMD的生物學效應，或以ADM22-52或CGRP8-37阻斷IMD受體后，再以肥大刺激劑AngⅡ共孵育，則可觀察到AngⅡ所誘導的心肌細胞肥大反應明顯增強。

上述結果證實IMD具有抗心肌細胞肥大作用，且內源性IMD作為心臟重要的旁/自分泌因子，參與了心肌肥大的發生、發展，并可能在其中發揮重要的調節作用。對內源性IMD及其受體系統生成、表達的干預是否可作為今后防治心肌細胞肥大新的作用途徑值得進一步研究。

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