三七莖葉皂苷對大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷的保護作用

任小宇，孫桂波，張 強，徐惠波，孫曉波

(1.黑龍江中醫藥大學藥學院，黑龍江哈爾濱 150040;2.遼東學院醫學院基礎醫學教學部，遼寧丹東 118003;3.中國醫學科學院藥用植物研究所，北京 100193;4.溫州醫學院，浙江溫州 325035;5.吉林省中醫藥科學院，吉林長春 130011)

三七是五加科多年生人參屬植物，具有止血祛淤、消腫止痛的功效。傳統中醫多以根入藥。其主要活性成分為皂苷類成分。近年來因三七的價格增長過快，使以三七根莖為原料的制劑均出現成本難以控制、企業難以承受的局面。但市場對三七入藥的產品需求卻不斷增加，因此，綜合利用和開發三七各活性部位對充分研發和利用三七具有重要意義。三七莖葉是三七的活性部位。其主要活性成分三七莖葉皂苷(panex notoginsegnoside of the leaves，PnGL)屬于達瑪烷型三萜皂苷。與傳統入藥部位三七根皂苷相比，藥理活性、作用相似［1］，但所含化學成分卻差別迥異。對三七莖葉的化學研究表明，其主要含有原人參二醇型皂苷，幾乎不含原人參三醇型皂苷，這是與三七主根皂苷的最大不同點。另外，三七莖葉具有資源豐富、來源廣泛、價格低廉的特點。利用三七莖葉皂苷，現在我們已開發了一種對腦血管疾病有治療作用的五類新藥，正在開展三期臨床實驗。進一步深入研究PnGL在心血管方面的藥理作用對三七的綜合利用開發具有重要意義。目前，文獻報道表明，PnGL在鎮靜、抗炎等方面具有明顯的藥理活性［2－3］，但其在心血管藥理方面報道鮮見。本實驗選用 Langendorff離體灌流技術，觀察PnGL對離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型的影響，旨在為PnGL的研究和開發及抗心肌缺血藥物的探索提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 選用SPF級SD大鼠，♂，體質量330～380 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。合格證號:SCXK(京)2006-2009。

1.2 藥品和試劑 PnGL:棕黃色粉末，由吉林省中醫藥科學院提供。臨用前溶于K-H液中配成所需濃度。K-H液成分如下(g·L－1):NaCl 6.8912、NaHCO32.09、KCl 0.35015、KH2PO40.1606、GLU l.998、MgSO4·7H2O 0.2908、CaCl20.283，pH 7.4。地奧心血康，成都地奧制藥集團有限公司生產，批號Z10910051。乳酸脫氫酶、肌酸激酶、SOD、MDA、GSH-Px試劑盒購自南京建成生物醫學工程研究所。

1.3 儀器 美國Radnoti離體灌流系統;成都泰盟BL-420/820四道生理記錄儀;天津奧特賽恩斯AP-01P型真空泵;梅特勒pH計。DY89-Π型電動玻璃勻漿機;MQX200型酶標儀;TGL-16高速臺式冷凍離心機。

1.4 方法

1.4.1 離體心臟Langendorff灌流模型制備 SD大鼠經20%烏拉坦(腹腔注射)麻醉后，舌下靜脈注射肝素鈉(25 mg·kg－1)行肝素化。迅速開胸，取心臟，懸掛于Langendorff灌流裝置上，以恒溫(37℃)，充二元氧(95%O2，5%CO2)，K-H液持續逆流灌流，流速為10 ～15 ml·min－1。采用左心室內水囊傳遞壓力測定心室內壓，通過BL-420生物信號采集系統記錄左室收縮曲線，計算左心室各項心功能指標，包括左室收縮壓(LVSP)、左室發展壓(LVDP)、左室內壓最大上升速率(+dp/dtmax)、左室內壓最大下降速率(－dp/dtmax)。

1.4.2 PnGL對缺血/再灌注損傷模型的影響 SD大鼠36只，隨機分為6組(n=6)，分別是空白對照組、模型組、陽性給藥組(地奧心血康 70 mg·kg－1)、PnGL 低、中、高劑量組(20、40、80 mg·kg－1)。陽性給藥組和PnGL給藥組大鼠每日灌胃給藥1次，連續給藥7 d，空白對照組和模型組同時給予同體積生理鹽水。末次給藥60 min后，分離心臟置于Langendorff離體灌流裝置上，各組心臟平衡15 min后，缺血/再灌注(I/R)組;陽性給藥組(地奧心血康);PnGL低、中、高劑量組(20、40、80 mg·L－1)，全心停灌25 min，再灌注 60 min，造成心肌缺血/再灌注損傷模型。正常對照組心臟平衡后持續灌流85 min。

1.5 檢測指標

1.5.1 血流動力學指標的測定 在左心耳根部剪一小口，從此處插入球囊(接BL/420信號采集系統)至左心室記錄血流動力學指標，實時記錄血流動力學指標:LVSP、LVDP、±dp/dtmax、HR。

1.5.2 冠脈流出液中LDH、CK的測定 再灌注60 min時取灌流液于－80℃凍存待測。標本收集后用生化試劑盒測定其活性。

1.5.3 心肌組織中 SOD、GSH-Px活性、MDA 含量及LDH，CK活性檢測 灌流完畢后取下心臟，于－80℃凍存，標本收集后用相應生化試劑盒測定其活力和含量。

1.6 病理組織學觀察心肌損傷程度 取出心臟，用4%多聚甲醛液固定，制成石蠟切片，從心尖至心底連續切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察。

Tab 1 Effects of PnGL on isolated cardiac function recovery rate(reperfusion for 60min)in rats(±s，n=6)

Tab 1 Effects of PnGL on isolated cardiac function recovery rate(reperfusion for 60min)in rats(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs normal;#P＜0.05 vs model

Group Reperfusion 60 min recovery rate/%LVSP LVDP +dp/dt －dp/dt HR Normal control 87.09 ±12.6 84.94 ±13.1 93.98 ±14.7 86.20 ±12.0 98.98 ±7.07 Model 76.28 ±9.69 37.20 ±9.37＊＊ 34.09 ±8.14＊＊ 32.91 ±10.1＊＊ 62.62 ±15.0＊＊Positive drug 78.09 ±11.3 70.31 ±13.8## 68.44 ±12.9## 65.07 ±11.1# 80.39 ±15.7 Low 70.00 ±17.6 49.59 ±10.7 58.16 ±11.5 52.96 ±12.3 65.92 ±18.0 Middle 73.13 ±26.0 55.64 ±11.9 65.08 ±13.3# 62.79 ±14.5# 80.85 ±14.3 High 89.84 ±16.9 84.49 ±18.6## 82.85 ±20.5## 73.08 ±19.3##84.27 ±20.7

Tab 2 Effect of PnGL on LDH and CK release in perfusate and myocardial tissue after I/R injury

2 結果

2.1 PnGL對大鼠離體缺血/再灌注心肌血流動力學的影響 各組大鼠離體心臟在I/R前平衡時血流動力學指標差異無統計學意義。再灌注60 min時，與空白組比較，模型組LVDP、±dp/dtmax明顯下降(P＜0.05)。與模型組比較，陽性給藥組、PnGL高、中劑量組上述指標均有明顯改善。提示:PnGL可明顯改善受損心肌的舒縮功能，降低I/R損傷對心肌舒縮功能的抑制作用。見Tab 1。

2.2 PnGL對大鼠離體缺血/再灌注心臟組織和冠脈流出液中LDH、CK活性的影響 與空白組比較，模型組心肌組織中LDH、CK的活性明顯降低，差異具有顯著性(P＜0.05);而灌流液中LDH、CK的活性明顯增高，差異具有顯著性(P＜0.05)。與模型組比較，陽性藥組再灌注后60 min組織中LDH、CK活性增高(P＜0.05);灌流液中LDH、CK活性降低(P＜0.05)。PnGL高、中、低3個劑量組再灌注后60 min組織中LDH、CK活性增高(P＜0.05);灌流液中LDH、CK活性降低(P＜0.05)。提示PnGL通過增強心肌細胞膜穩定性而降低缺血/再灌注心肌的損傷，發揮保護心肌的作用。結果見Tab 2。

2.3 PnGL對離體大鼠缺血/再灌注心肌組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響 與空白組比較，缺血/再灌注模型組心肌組織中SOD、GSHPx活性下降(P＜0.01)，MDA含量增加(P＜0.01)。與模型組比較，陽性給藥組和PnGL中、高兩個劑量組 SOD、GSH-Px活性增加，MDA含量降低，并呈一定量效關系，差異具有統計學意義(P＜0.05)。提示PnGL可提高缺血/再灌注心肌組織中SOD、GSH-Px活性、降低MDA含量，增強心肌的抗氧化能力。見Tab 3。

Tab 3 Effects of PnGL on the content of MDA，SOD and GSH-Px activities in myocardial tissue after I/R

2.4 HE染色光學顯微鏡觀察心肌結構 顯微鏡下觀察:正常對照組:心肌組織結構基本無異常，心肌細胞排列比較整齊，橫紋比較清楚(Fig 1A)。I/R組:心肌纖維排列紊亂，出現多處斷裂，間質增寬、水腫，局部呈現波浪形，可見多處變性壞死灶，程度較重，胞質有溶解現象，壞死心肌肌漿呈嗜伊紅染的條帶或斑塊，心肌纖維間可見大量炎細胞浸潤(Fig 1B)。陽性給藥組:心肌纖維排列紊亂，可見變性壞死灶，但程度較輕，心肌纖維間可見少量炎細胞浸潤(Fig 1C)。PnGL高劑量組:可見輕度心肌纖維變性壞死灶，心肌纖維間可見少量炎性細胞浸潤(Fig 1D)。

Fig 1 Effect of PnGL on isolated myocardial ischemia-reperfusion injury of rats (HE×400)

3 討論

心肌缺血/再灌注可造成多種損傷后果，包括心臟舒縮功能抑制、細胞膜受損、心肌組織壞死等，其機制涉及自由基損傷及炎癥反應等［4］。

本實驗結果顯示，心肌缺血/再灌注60min后，模型組心肌舒縮功能嚴重受限，LVSP、LVDP、±dp/dt均明顯下降。PnGL預防性給藥后，高劑量組心功能上述指標恢復明顯、效果顯著。心肌缺血/再灌注損傷可通過多種因素造成心肌細胞破損，細胞膜通透性增加，繼而使細胞內的標志性心肌酶LDH、CK外漏致血清或灌流液中，同時造成心肌組織內酶活性降低［5］。本實驗酶學指標顯示，PnGL高劑量組酶學改變明顯減輕(LDH、CK，P＜0.05)，提示預先給藥PnGL可提高心肌細胞膜的穩定性，減少酶的外漏，繼而有效的保護心肌細胞。

心肌缺血/再灌注過程中大量氧自由基的生成是引起心肌缺血/再灌注損傷的主要機制之一［6］。大量的氧自由基生成可引起多種生物靶點的損傷，如蛋白質、DNA、脂質等，并可通過過氧化反應造成嚴重的生物膜損害，以及后續的細胞損傷或者死亡［7－9］。機體存在 SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等內源性抗氧化防御系統。SOD能催化超氧自由基歧化為過氧化氫，繼而在GSH-PX作用下使過氧化氫降解為水和氧氣［10］。MDA的含量常常可反映機體內的脂質過氧化的程度，間接反映心肌細胞受自由基攻擊的嚴重程度和細胞損傷的程度［11］。抗氧化系統防御能力的增強有利于減輕組織氧化損傷，能有效保護組織細胞。PnGL可提高心肌組織中SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量。表明PnGL可能通過清除氧自由基起到保護心肌的作用。

研究發現，早期炎癥反應是加重心肌損傷的重要因素之一［12］。另外，能否縮小心肌壞死面積或減輕心肌壞死程度是評價藥物對缺血性心肌病療效的重要指標。本實驗HE染色結果顯示，模型組心肌組織結構紊亂，可見多處變性壞死灶，胞質出現溶解，程度較重，心肌纖維間可見大量炎細胞浸潤。預防性給予PnGL后，與模型組比較，PnGL高劑量組心肌組織結構紊亂現象明顯減輕，斷裂、彎曲現象減少。壞死灶明顯縮小，壞死程度明顯減輕。間質中炎細胞浸潤明顯減少，炎癥反應明顯減弱。染色結果表明，預防性給予PnGL對缺血/再灌注心肌組織具有明顯的保護作用。

綜上所述，預防性給予PnGL能減輕心肌再灌注所造成的多種損傷，其對心肌組織的保護作用可能是多方面的。既可減輕由缺血/再灌注導致的心功能抑制，減少標志性心肌酶的釋放，又可降低心肌組織變性壞死程度，減少炎細胞的浸潤。其保護機制部分可能與抗自由基損傷有關，但其確切的作用機制有待于多方面、多層次的深入研究，尤其是研究其對抗心肌缺血/再灌注損傷的作用靶點及相關的信號通路，將對進一步揭開PnGL心肌保護的作用機制具有重要意義。

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