鉤藤生物堿抑制高血壓大鼠主動脈膠原沉積及對基質(zhì)金屬蛋白酶的影響

姜月華，孫敬昌，周洪雷，王永瑞，李運倫

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東濟南 250011;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟南 250355)

鉤藤堿(rhynchophylline)和異鉤藤堿(isorhynchophylline)是從中藥材鉤藤中分離、提純的生物堿，是鉤藤發(fā)揮降壓效應(yīng)的主要成分。前期研究表明鉤藤堿和異鉤藤堿能降低自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertension rats，SHR)胸主動脈和腸系膜動脈中膜厚度/管腔直徑比值，改善胸主動脈和腸系膜動脈病理組織學(xué)損害［1］，調(diào)控SHR胸主動脈平滑肌細胞的凋亡，抑制胸主動脈平滑肌細胞的增殖［2－3］，但鉤藤堿和異鉤藤堿能否抑制SHR動脈壁膠原的沉積及作用機制尚不清楚。本文研究鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿(Uncaria alkaloids)對SHR胸主動脈Ⅰ型膠原(Collagen typeⅠ，ColⅠ)和Ⅲ型膠原(CollagentypeⅢ，ColⅢ)的影響，并進一步觀察其對動脈壁基質(zhì)金屬蛋白酶(marix metalloproteinase，MMP)-9、MMP-2以及其組織抑制因子(tissue inhititor of metalloproteinase，TIMP)-2 的作用，探討其可能存在的抗高血壓動脈膠原重塑的機制，從而為鉤藤生物堿的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 ♂SHR 40只，8周齡，體質(zhì)量192～217 g，由北京維通利華實驗動物中心提供［許可證:SCXK(京)2006-0009］;♂Wistar大鼠8只，8周齡，體質(zhì)量196～220 g，山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供［許可證:SCXL(魯)20051015］。

1.2 試劑與材料 鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿:由山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院周洪雷教授提供，純度分別為0.997、0.997 和 0.80，用前經(jīng) 0.1 mol·L－1HCl溶解后，分別用蒸餾水稀釋為0.5、0.5和5 g·L－1，調(diào)pH至7.2。置4℃冰箱保存?zhèn)溆茫褂们罢袷帲浞謸u勻。卡托普利(captopril):濟南東風(fēng)制藥有限公司，魯藥準字(2001)第027510號，生產(chǎn)批號0208023，25 mg/片。實驗前加適量生理鹽水，配制成1.75 g·L－1的混懸液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩＜从眯蚐ABC免疫組化染色檢測試劑盒、ColⅠ兔多抗IgG、ColⅠmRNA原位雜交檢測試劑盒、ColⅢ兔多抗IgG、ColⅢ mRNA原位雜交檢測試劑盒、DAB顯色劑、生物素化山羊抗兔IgG，武漢博士德生物工程有限公司。MMP-9鼠單抗 IgG、MMP-2鼠單抗 IgG、TIMP-2鼠單抗IgG、MMP-9原位雜交檢測試劑盒、TIMP-2原位雜交檢測試劑盒，北京中杉金橋生物制品有限公司產(chǎn)品。

1.3 動物分組給藥 將SHR隨機分為5組:模型組、卡托普利組、異鉤藤堿組、鉤藤堿組和鉤藤總生物堿組。Wistar大鼠8只作為正常組。卡托普利組給藥量為每天17.5 mg·kg－1，異鉤藤堿組、鉤藤堿組和鉤藤總生物堿組的給藥量分別為每天5、5和50 mg·kg－1，模型組和正常組給予等容量生理鹽水。給藥容積為每次10 ml·kg－1，灌胃給藥，每周給藥6 d，每天下午定時給藥，連續(xù)8周，并隨體質(zhì)量變化調(diào)整給藥量。

1.4 動脈留取 末次用藥24 h后，禁食12 h(不禁水)，用質(zhì)量濃度為0.02 g·L－1的戊巴比妥鈉2 ml·kg－1體重腹腔注射麻醉，下腔靜脈取血。取血后立即從頸靜脈穿刺插管，用4℃生理鹽水約50 ml快速灌注沖洗，待沖洗液無色后，快速分離、摘取胸主動脈，分為2份:一份用體積分數(shù)為0.1的甲醛固定，石蠟包埋，用于免疫組化檢測;一份用體積分數(shù)為0.04的多聚甲醛固定，石蠟包埋，用于原位雜交檢測。

1.5 胸主動脈膠原的定性檢測 采用Masson染色法。

1.6 胸主動脈 ColⅠ、ColⅢ、MMP-9、MMP-2 和TIMP-2的蛋白表達檢測 采用免疫組織化學(xué)SABC法:石蠟切片脫蠟至水，體積分數(shù)為0.03的H2O2室溫10 min，PBS洗5 min×3次，微波修復(fù)抗原，體積分數(shù)為0.05的BSA封閉20 min，滴加親和純化ColⅠ兔多抗IgG或ColⅢ兔多抗IgG或MMP-9鼠單抗IgG或TIMP-2鼠單抗IgG(1∶100倍稀釋)，濕盒內(nèi)37℃ 1 h，PBS代替一抗作為陰性對照，PBS洗2 min×3次，滴加生物素化山羊抗兔 IgG，37℃20 min，PBS洗 2 min ×3 次，滴加試劑 SABC，37℃20 min，PBS洗5 min×4次，DAB顯色，鏡下控制時間，蒸餾水洗滌，脫水，透明，中性樹膠封片。任選5個視野用Image-Pro Plus 4.5圖像分析軟件對結(jié)果進行半定量分析，測定平均灰度，以均值作為該樣本ColⅠ、ColⅢ、MMP-9和 TIMP-2的相對表達量。

1.7 胸主動脈 ColⅠ、ColⅢ、MMP-9和 TIMP-2的mRNA表達檢測 采用原位雜交法，嚴格按照試劑盒說明進行操作。并用Image-Pro Plus 4.5圖像分析軟件對結(jié)果進行半定量分析，測定平均灰度，以此作為該樣本 ColⅠ、ColⅢ、MMP-9和 TIMP-2的mRNA相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組胸主動脈和腎動脈膠原含量的定性檢測在Masson染色下膠原纖維呈綠色。正常組大鼠胸主動脈、腎動脈壁存在膠原纖維表達，而SHR模型組大鼠胸主動脈、腎動脈壁膠原纖維表達較強，綠色表現(xiàn)較重。與模型組比較，各用藥組胸主動脈、腎動脈壁膠原纖維表達均有不同程度的減輕，綠色表現(xiàn)有不同程度變淺。見Fig 1。

Fig 1 Masson staining of thoracic aorta

2.2 各組胸主動脈ColⅠ和ColⅢ的蛋白表達檢測如Tab 1示，與模型組相比，鉤藤堿組、異鉤藤堿組和鉤藤總生物堿組大鼠胸主動脈Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的蛋白質(zhì)表達、mRNA表達均降低(P＜0.05)。

2.3 各組胸主動脈MMP-9、MMP-2、TIMP-2蛋白表達的比較 如Tab 2示，與模型組相比，鉤藤堿組、異鉤藤堿組和鉤藤總生物堿組大鼠胸主動脈MMP-9和MMP-2蛋白質(zhì)表達均升高(P＜0.01)，而TIMP-2蛋白質(zhì)表達均降低(P＜0.05)。與模型組相比，大鼠胸主動脈鉤藤堿組、異鉤藤堿組和鉤藤總生物堿組MMP-9 mRNA表達均升高(P＜0.01～0.05)，而TIMP-2 mRNA表達均降低(P＜0.05)。

3 討論

膠原在人類和動物血管組織中普遍存在，是血管壁細胞外基質(zhì)的主要成分，占細胞外基質(zhì)含量0.8～0.9，其中又以Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原為主。膠原除了作為血管壁的支撐材料外，還可以影響血管壁的組織結(jié)構(gòu)。在高血壓的病理進程中，大動脈壁膠原的合成與降解相伴行，正由于大動脈壁膠原過度合成、降解不足、合成與降解之間的動態(tài)平衡被打破，導(dǎo)致大動脈壁膠原異常沉積［4－5］。因此，促進大動脈壁膠原降解，抑制大動脈壁膠原合成不僅是抗大動脈壁膠原沉積的基本策略，同時也是抗高血壓血管重塑的重要目標。

Tab 1ColⅠand ColⅢprotein expression and mRNA expression of thoracic aorta(±s，n=8)

Tab 1ColⅠand ColⅢprotein expression and mRNA expression of thoracic aorta(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model

?

Tab 2MMP-9 and TIMP-2 protein expression and mRNA expression of thoracic aorta(±s，n=8)

Tab 2MMP-9 and TIMP-2 protein expression and mRNA expression of thoracic aorta(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model

?

自發(fā)性高血壓大鼠是篩選抗高血壓藥物最適宜的動物模型，且出現(xiàn)血管周圍間質(zhì)膠原纖維明顯增生、血管中膜增厚、管壁厚度增加、彈性纖維板部分斷裂等大動脈硬化的表現(xiàn)［6－7］，故本實驗以SHR胸主動脈作為高血壓大動脈膠原沉積模型，探討鉤藤生物堿在降低血壓的同時對SHR胸主動脈膠原沉積的影響，分析Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達的特征。結(jié)果顯示SHR胸主動脈存在膠原沉積、胸主動脈ColⅠ、ColⅢ蛋白表達及 ColⅠmRNA、ColⅢ mRNA轉(zhuǎn)錄增多，經(jīng)鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿干預(yù)，SHR胸主動脈膠原沉積減輕，胸主動脈ColⅠ、ColⅢ蛋白表達及ColⅠmRNA、ColⅢ mRNA轉(zhuǎn)錄均降低，表明鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿有抑制SHR胸主動脈的膠原沉積的效應(yīng)，其機制與下調(diào)SHR胸主動脈壁ColⅠ、ColⅢ蛋白和mRNA的表達有關(guān)。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組依賴Zn2+并以細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分為水解底物的蛋白水解酶，MMPs通過對ECM成分的水解，影響其水解與重組的動態(tài)平衡，MMP-2和MMP-9是MMPs的重要成員;MMPs的組織抑制因子(tissue inhibitors of the matrix metalloproteinases，TIMPs)是MMPs的天然抑制劑，TIMP-2是TIMPs家族的重要成員。在病理狀態(tài)下，TIMPs水平改變直接影響MMPs活性的高低。MMPs及其抑制劑TIMPs調(diào)控細胞外基質(zhì)的代謝，兩者的動態(tài)平衡維持血管的正常形態(tài)和功能，動脈壁MMP-9和MMP-2異常表達參與了高血壓病早期血管重塑的病理進程［8－14］。本實驗發(fā)現(xiàn)，在SHR胸主動脈存在MMP-9和MMP-2蛋白和mRNA低表達、TIMP-2蛋白和TIMP-2 mRNA高表達現(xiàn)象，經(jīng)鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿干預(yù)后，SHR胸主動脈MMP-9和MMP-2蛋白和mRNA表達上調(diào)，TIMP-2蛋白和mRNA表達下調(diào)。從而表明鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿可通過上調(diào)MMP-9和 MMP-2蛋白和 mRNA表達、下調(diào)TIMP-2蛋白和mRNA表達來抑制SHR胸主動脈膠原沉積效應(yīng)。

綜上所述，鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿對SHR胸主動脈膠原沉積具有抑制作用，其機制與下調(diào)SHR胸主動脈壁ColⅠ、ColⅢ蛋白和mRNA表達有關(guān)，更深入的機制與上調(diào)MMP-9蛋白和mRNA表達、上調(diào)MMP-2蛋白表達、下調(diào)TIMP-2蛋白和mRNA表達有關(guān)，體現(xiàn)了中藥多途徑、多靶點及整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢，從而可以推斷鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿對防治高血壓大動脈硬化的發(fā)生發(fā)展具有積極的意義。至于鉤藤生物堿抑制膠原沉積的機制是降低血壓繼發(fā)的膠原抑制效應(yīng)還是獨立于降壓效應(yīng)之外的靶向性膠原抑制效應(yīng)抑或是二者兼有，尚有待于進一步探討。

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