二氮嗪后處理對缺血/再灌注心肌的保護作用及其與PI3K/Akt信號通路的關系

趙其宏，張 穎，梁啟勝，欒恒飛，葉 英，曾因明

(1.蚌埠醫學院第一附屬醫院麻醉科，安徽 蚌埠 233004;2.江蘇省麻醉學重點實驗室，江蘇徐州 221002)

二氮嗪是美國60代初期合成的噻嗪類衍生物，早期臨床上用于治療高血壓危象。自Garlid等［1］1997年首次報道二氮嗪預處理通過開放心肌細胞線粒體ATP敏感性鉀通道產生與缺血預處理類似的心肌保護效應以來，眾多研究顯示，二氮嗪預處理［2］和后處理［3］均是通過開放線粒體 ATP敏感性鉀通道而發揮心肌保護效應的。但最近研究表明［4］，二氮嗪預處理減輕心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷的作用還與磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路有關。PI3K/Akt信號通路是細胞內重要的生存通路，該通路于心肌I/R期間的急性激活參與多種藥物后處理的心肌保護作用［5－6］。但在二氮嗪后處理中，PI3K/Akt信號通路的作用尚未見報道。本文旨在研究PI3K/Akt信號通路在二氮嗪后處理心肌保護中的作用，為二氮嗪用于心肌保護提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 二氮嗪、wortmannin(Sigma);氯化三苯基四氮唑(tripheny tetrazolium chloride，TTC)(Amresco);兔抗磷酸化Akt(Ser473)多克隆抗體(Cell Signaling);兔抗Akt多克隆抗體(Bioworld);小鼠抗β-actin單克隆抗體、堿性磷酸酶標記山羊抗兔lgG、堿性磷酸酶標記馬抗小鼠lgG(中杉金橋生物公司);TUNEL試劑盒(Roche)。

1.2 儀器 DH-150型小動物呼吸機(浙江大學醫學儀器廠，杭州)，BL-420s生物機能實驗系統(泰盟科技有限公司，成都)，TE-312型微量注射泵(Terumo公司，日本)，Bx50F4型光學顯微鏡(Olympus公司，日本);COOLPIX S1型照相機(Nikon公司，日本)。

1.3 動物與分組 60只清潔級成年♂SD大鼠(由徐州醫學院實驗動物中心提供)，體質量250～300 g，隨機分為5組(n=12):假手術組(S組)、I/R組、二氮嗪后處理組(D組)、wortmannin組(W組)和二氮嗪后處理+wortmannin組(D+W組)。

1.4 方法 參照文獻［7－8］，稍作改進建立動物模型:腹腔注射10%水合氯醛(400 mg·kg－1)麻醉，肝素鈉(500 U·kg－1)抗凝，記錄Ⅱ導聯心電圖，股靜脈穿刺后連接輸液泵，氣管插管，機械通氣(呼吸頻率:75次/min;潮氣量:6～8 ml;吸 ∶呼=1∶2)，胸骨左緣3～4肋間進胸暴露心臟，在左心耳根部與肺動脈圓錐間下方約2 mm處進針、穿線(橫跨左冠狀動脈前降支)，在線環內放一小段硅膠管，穩定20 min后結扎縫線30 min，剪斷線結進行再灌注120 min。S組只穿縫線，不結扎，25 min后經股靜脈輸入0.1%DMSO;其余各組均進行30 min缺血和120 min再灌注。缺血25 min后，I/R組、D組、W組和D+W組分別經股靜脈輸注0.1%DMSO、二氮嗪28 mg·kg－1·h－1、PI3K 抑制劑 wortmannin 60 μg·kg－1·h－1和二氮嗪 28 mg·kg－1·h－1，其中 D+W組于輸注二氮嗪前5 min靜脈輸注wortmannin 60 μg·kg－1·h－1，所有藥物均持續輸注 15 min;二氮嗪和wortmannin均用0.1%DMSO稀釋。

1.5 指標檢測

1.5.1 心功能指標 氣管插管機械通氣后，每組取8只大鼠，用動脈夾阻斷右頸總動脈血流并在其上剪一V字型破口，將充滿肝素水且一端連接BL-420s生物機能實驗系統的PE-50導管逆行插管至左心室，連續監測心率(HR)、左室發展壓(LVDP)和左室舒張末壓(LVEDP)。

1.5.2 心肌梗死面積比率 每組取6只大鼠，再灌注末取下心臟并置于－20℃冰箱中10 min，取出后沿垂直心臟縱軸方向從心尖到結扎線下方將其切成2～3 mm厚的薄片，共5片，然后置于1%TTC磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)中，37℃孵育15 min，4%中性甲醛固定過夜，梗死區心肌為灰白色;心肌梗死面積比率/%=所有切片梗死面積之和/(左心室面積+右心室面積)×100%。

1.5.3 心肌凋亡率 每組取3只大鼠，再灌注末迅速剪取左心室前壁心肌組織浸入4%中性甲醛中固定24 h，自動脫水機脫水，石蠟包埋、切片，按TUNEL試劑盒說明進行染色，凋亡的細胞核被染成棕褐色，未凋亡的細胞核為深藍色。高倍鏡(×400)下每張切片隨機選取10個互不重疊視野計算凋亡率:凋亡率/%=(視野內凋亡細胞個數/視野內所有細胞個數)×100%。

1.5.4 p-Akt與總 Akt表達情況 每組取3只大鼠，實驗結束后迅速剪取左心室前壁心肌組織，立即放入－70℃冰箱中保存，標本取齊后在冰上剪碎、勻漿、裂解，4℃ 12 000×g離心10 min，取上清，蛋白濃度配平、變性后放入－20℃冰箱中備用。取等量蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，分離后將蛋白電轉移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h。加入1∶1 000的小鼠抗β-actin單克隆抗體或兔抗p-Akt(Ser473)多克隆抗體或兔抗Akt多克隆抗體中，4℃孵育過夜。取出后漂洗，加入堿性磷酸酶標記的二抗(1∶1 000)，振蕩孵育2 h。漂洗后，BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯色。條帶掃描后分析灰度值。

1.6 統計學處理 用 SPSS 13.0軟件進行統計學處理，數據以±s表示。心功能指標分析采用雙因素重復測量方差分析;其余數據采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。

2 結果

2.1 心功能指標 各組缺血前心功能指標差異無統計學意義(P＞0.05)。再灌注120 min后，與S組相比，其余4組HR和LVDP降低而LVEDP增加(P＜0.01);與I/R組比，D組與D+W組LVDP增加(P＜0.01)，LVEDP降低(P＜0.05或0.01);與 D組比，D+W組LVDP降低(P＜0.05)。見Tab 1。

2.2 心肌梗死面積 除S組外，其余4組再灌注末均有明顯的心肌梗死發生。與I/R組相比，D組和D+W組心肌梗死面積明顯減小(P＜0.01或0.05);與D組比，D+W組心肌梗死面積增加(P＜0.05)。見Fig 1。

2.3 心肌細胞凋亡率 與S組相比，其余4組凋亡率增加(P＜0.01);與I/R組相比，D組與D+W組凋亡率降低(P＜0.01);與D組比，D+W組凋亡率增加(P＜0.05)。見Fig 2。

2.4 p-Akt的表達情況 D組p-Akt表達水平明顯高于其余4組(P＜0.01);I/R組、S組和D+W組間差異無統計學意義(P＞0.05)。見Fig 3。

3 討論

本實驗采用的在體左冠狀動脈前降支結扎術是國內外常用的模型，具有很好的穩定性和重復性。本研究結果表明，再灌注120 min后，除S組外，其余4組均發生明顯的心肌梗死，提示心臟I/R模型制備成功。心肌I/R損傷與其經受缺血時間的長短有關，本研究采用的缺血30 min、再灌注120 min能夠很好地誘導心肌I/R損傷［7］和心肌凋亡［8］。

Fig 1 Myocardial infarct size at 120 min reperfusion after 30 min ischemia in different groups(±s，n=6)

Tab 1Comparation of hemodynamic parameter among five groups(±s，n=8)

Tab 1Comparation of hemodynamic parameter among five groups(±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs baseline;+P＜0.05，++P＜0.01 vs S;#P＜0.05，##P＜0.01 vs I/R;△P＜0.05 vs D

Variable Group Baseline 30 min ischemia 120 mi n reperfusion HR/beats·min－1 S 372±44 370±41 342±38＊＊I/R 366±42 301±29＊＊++ 256±31＊＊++D 379±48 316±44＊＊+ 300±51＊＊+#W 360±38 302±39＊＊++ 248±25＊＊++D+W 351±36 319±44＊＊+ 280±49＊＊++LVDP/kPa S 16.3 ±2.3 16.0 ±2.2 15.6 ±1.6*I/R 17.1 ±1.9 11.2 ±0.7＊＊++ 4.8 ±0.8＊＊++D 15.8 ±1.9 10.6 ±0.9＊＊++ 8.6 ±0.9＊＊++##W 16.5 ±2.3 11.3 ±1.0＊＊++ 4.5 ±0.3＊＊++D+W 16.0 ±1.6 10.8 ±0.8＊＊++ 6.7 ±0.6＊＊++##△LVEDP/kPa S 0.20 ±0.19 0.20 ±0.20 0.23 ±0.28 I/R 0.06 ±0.22 1.30 ±0.54＊＊++ 2.12 ±0.50＊＊++D 0.13 ±0.29 1.07 ±0.46＊＊++ 1.20 ±0.37＊＊##W 0.24 ±0.19 1.43 ±0.62＊＊++ 2.18 ±0.65＊＊++D+W 0.23 ±0.30 1.08 ±0.54＊＊++ 1.65 ±0.37＊＊++#

HR和LVDP均是反映左心室收縮功能的指標，但LVDP更敏感;LVEDP則反映左心室的舒張功能。本實驗顯示二氮嗪后處理能夠明顯改善心肌收縮和舒張功能，而PI3K抑制劑wortmannin則部分逆轉左心室收縮功能的改善。本研究還提示，wortmannin部分消除二氮嗪后處理減小大鼠在體I/R心肌的梗死面積，與 Matejíková 等［4］對二氮嗪預處理離體灌注大鼠心臟的研究結果相似。此外，二氮嗪后處理還明顯減少I/R誘導的心肌凋亡，wortmannin部分消除這一作用。進一步Western blot分析p-Akt顯示，二氮嗪后處理引起p-Akt表達的增加;而wortmannin消除這一效應。p-Akt表達水平的變化與心肌保護效應變化的趨勢一致;但wortmannin完全抑制PI3K/Akt信號通路后，二氮嗪后處理的心肌保護效應只是部分被消除，說明尚有其他機制參與，本實驗未作進一步研究。

Fig 2 A:Apoptotic cells in rat hearts detected by TUNEL staining at 120 min reperfusion after 30 min ischemia in different groups(×400，bar=50μm);B:Apoptotic rate of myocardial cells at 120 min reperfusion after 30 min ischemia in different groups(±s，n=3)

本研究選擇的二氮嗪劑量為7 mg·kg－1，這一劑量已被證實對大鼠心肌具有良好的保護作用［2］。本實驗選用的PI3K抑制劑為wortmannin，它與ATP催化位點共價結合而不引起電生理效應［9］;因此，不影響心肌收縮和舒張功能。此外，本實驗所用的wortmannin劑量能夠很好地阻斷缺血預處理［10］和缺血后處理［11］引起的Akt磷酸化。

Fig 3 A:Western blot Akt and p-Akt in myocardial tissue at 120 min reperfusion after 30 min ischemia;B:Graphic presentation of p-Akt in myocardial tissue at 120 min reperfusion after 30 min ischemia(±s，n=3)

綜上所述，本研究結果提示二氮嗪后處理部分通過激活PI3K/Akt信號通路減輕大鼠在體心肌I/R損傷，但PI3K/Akt信號通路是通過何種機制被激活以及該通路活化后如何發揮心肌保護作用，還有待于進一步研究。

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