熊膽粉微生物限度檢查方法學驗證

楊務彬 李元宏 蘭 鴻

湖北醫藥學院附屬太和醫院藥學部，湖北 十堰 442000

熊膽粉為熊科動物黑熊Selenaretos thibetanus Cuvier經膽囊手術引流膽汁而得的干燥品，收載于國家藥品標準《新藥轉正標準》第11冊[1]，本品有一定的抑菌作用[2]，但其微生物限度檢查一直采用常規方法檢驗，根據《中國藥典》2010年版的要求，對原用的常規方法進行驗證[3]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LDZX-40BI立式自動電熱壓力蒸氣滅菌器（上海申安醫療器械廠），DNP-9162型電熱恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司），HH B11 600型電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠），LRH-150B生化培養箱（廣東醫療器械廠），超凈臺（蘇凈集團安泰公司）。

1.2 培養基

營養肉湯培養基，改良馬丁培養基，營養瓊脂培養基，玫瑰紅鈉瓊脂培養基，膽鹽乳糖培養基，甘露醇氯化鈉瓊脂培養基，溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基，曙紅亞甲藍瓊脂培養基（EMB），四硫磺酸鈉亮綠培養基（TTB），膽鹽硫乳瓊脂培養基（DHL），均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.3 陽性對照菌

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，大腸埃希菌[CMCC（B）44102]，枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]，銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]，乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50094]，白色念珠菌[CMCC（F）98001]，黑曲霉菌[CMCC（F）98003]，均購自四川省食品藥品檢驗所。

1.4 供試品

熊膽粉（購自四川省新鹿藥業有限公司，批號：091203、091204、091205）。

2 方法與結果

2.1 供試液的制備

2.1.1 供試液制備方法1

取供試品10 g，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，混勻，作為 1∶10 供試液。

2.1.2 供試液制備方法2

取1∶10供試液25 mL加pH 7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至50 mL，混勻，作為1∶20供試液。

2.2 陽性對照菌液的制備

將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物接種于營養肉湯培養基中，30～35℃培養18 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋制成每1 mL中含菌數為50～100 cfu的菌懸液，備用；接種白色念珠菌的新鮮培養物于改良馬丁瓊脂培養基中，25℃培養24 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋制成每1 mL中含菌數為50～100 cfu的菌懸液，備用；接種黑曲霉的新鮮培養物于改良馬丁瓊脂斜面培養基上，25℃培養5 d，加入5 mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫，吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋制成每1 mL含孢子數50～100 cfu的孢子懸液，備用。

2.3 檢查方法驗證[4]

2.3.1 試驗組

2.3.1.1 常規法 分別取1∶10供試液1 mL和試驗菌株的菌懸液 1 mL（50～100 cfu）入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度培養，觀察并計數。

2.3.1.2 培養基稀釋法1 分別取1∶10供試液0.2、0.1 mL（0.2、0.1 mL/皿）和試驗菌株的菌懸液 1 mL（50～100 cfu）入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度培養，觀察并計數。

2.3.1.3 培養基稀釋法2 分別取1∶20供試液0.1 mL（0.1 mL/皿）和試驗菌株的菌懸液 1 mL（50～100 cfu）入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度培養，觀察并計數。

2.3.2 菌液組

分別取1 mL試驗菌株（50～100 cfu）入平皿中，立即傾注瓊脂培養基混勻，待凝固后，置規定溫度培養，觀察并計數，每種菌各制備2個皿。

2.3.3 供試液本底測定

2.3.3.1 常規法 分別取1∶10供試液1 mL入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度培養，觀察并計數。

2.3.3.2 培養基稀釋法1 分別取1∶10供試液0.2、0.1 mL入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度培養，觀察并計數。

2.3.3.3 培養基稀釋法2 分別取1∶20供試液0.1 mL入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度培養，觀察并計數。

2.4 回收率測定

2.4.1 常規法測定

常規法測定回收率，白色念珠菌、黑曲霉菌、大腸埃希菌回收率均高于70%，可采用常規法進行霉菌、酵母菌計數；金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率低于70%，說明本品對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有較強的抑菌作用，細菌檢查不能采用常規法。見表1。

2.4.2 培養基稀釋法測定

2.4.2.1 培養基稀釋法（1∶10供試液，0.2 mL/皿）測定回收率 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌回收率高于70%，枯草芽孢桿菌回收率低于70%；采用培養基稀釋法（1∶10供試液，0.2 mL/皿）不可消除本品對枯草芽孢桿菌的抑菌作用。見表1。

2.4.2.2 培養基稀釋法（1∶10供試液，0.1 mL/皿）測定回收率 枯草芽孢桿菌回收率低于70%；采用培養基稀釋法（用1∶10供試液，0.1 mL/皿）不可消除本品對枯草芽孢桿菌的抑菌作用。

2.4.2.3 培養基稀釋法（1∶20供試液，0.1 mL/皿）測定回收率 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌3次獨立試驗回收率均高于70%；采用培養基稀釋法（1∶20供試液，0.1 mL/皿）可消除本品對枯草芽孢桿菌的抑菌作用。見表1。

2.5 控制菌檢查法驗證[5-6]

2.5.1 大腸埃希菌檢查法

分別取1∶10供試液10 mL，加入3瓶100 mL膽鹽乳糖培養基中，其中一瓶加入1 mL大腸埃希菌菌液（50～100個/mL）作為試驗組，一瓶加入1mL金黃色葡萄球菌菌液（50～100個/mL）作為陰性菌對照組；另取1瓶100 mL膽鹽乳糖培養基，加入1 mL大腸埃希菌菌液（50～100個/mL）作為大腸埃希菌陽性對照組。按大腸埃希菌檢查法檢驗，結果見表2。

表1 消除供試品抑菌活性回收率試驗

表2 大腸埃希菌檢查結果

由表2可知，陰性菌對照組未檢出大腸埃希菌，試驗組檢出大腸埃希菌。可采用常規法進行本品的大腸埃希菌檢查。

2.5.2 金黃色葡萄球菌檢查法

分別取 1∶10供試液 10 mL，加入 3瓶 100 mL營養肉湯培養基中，其中一瓶加入1 mL金黃色葡萄球菌菌液（50～100個/mL）作為試驗組，一瓶加入1 mL大腸埃希菌菌液（50～100個/mL）作為陰性菌對照組；另取100 mL營養肉湯培養基，加入1 mL金黃色葡萄球菌菌液（50～100個/mL）作為金黃色葡萄球菌陽性對照組。按金黃色葡萄球菌檢查法檢驗，結果見表3。

表3 金黃色葡萄球菌檢查結果

由表3可知，陰性菌對照組未檢出金黃色葡萄球菌，試驗組檢出金黃色葡萄球菌?？刹捎贸Ｒ幏ㄟM行本品的金黃色葡萄球菌檢查。

2.5.3 銅綠假單胞菌檢查法

分別取 1∶10供試液 10 mL，加入 3瓶 100 mL膽鹽乳糖培養基中，其中一瓶加入1 mL銅綠假單胞菌菌液（50～100個/mL）作為試驗組，一瓶加入1 mL大腸埃希菌菌液（50～100個/mL）作為陰性菌對照組；另取一瓶100 mL膽鹽乳糖培養基，加入1 mL銅綠假單胞菌菌液（50～100個/mL）作為銅綠假單胞菌陽性對照組。按銅綠假單胞菌檢查法檢驗，結果見表4。

由表4可知，陰性菌對照組未檢出銅綠假單胞菌，試驗組檢出銅綠假單胞菌?？刹捎贸Ｒ幏ㄟM行本品的銅綠假單胞菌檢查。

2.5.4 大腸菌群檢查法

分別取1∶10供試液1 mL，加入3管10 mL膽鹽乳糖發酵管中，其中一管加入1 mL大腸埃希菌菌液（50～100個/mL）作為試驗組，一管加入1 mL金黃色葡萄球菌菌液（50～100個/mL）作為陰性菌對照組；另取1管10 mL膽鹽乳糖發酵管，加入1 mL大腸埃希菌菌液（50～100個/mL）作為大腸菌群陽性對照組。按大腸菌群檢查法檢驗，結果見表5。

表4 銅綠假單胞菌檢查結果

表5 大腸菌群檢查結果

由表5可知，陰性菌對照組未檢出大腸菌群，試驗組檢出大腸菌群。可采用常規法進行本品的大腸菌群檢查。

2.5.5 沙門菌檢查法

分別取本品10 g，加入3瓶200 mL營養肉湯中，其中一瓶加入1 mL沙門菌菌液（50～100個/mL）作為試驗組，一瓶加入1 mL金黃色葡萄球菌菌液（50～100個/mL）作為陰性菌對照組；另取1瓶200 mL營養肉湯，加入1 mL沙門菌菌液（50～100個/mL）作為沙門菌陽性對照組，按沙門菌檢查法檢查。結果提示，陰性菌對照組未檢出沙門菌，試驗組未檢出沙門菌，但沙門菌陽性對照組檢出沙門菌，故不能采用常規法進行本品的沙門菌檢查。所以沙門菌檢查法調整為：分別取本品10 g，加入3瓶400 mL營養肉湯中，其中一瓶加入1 mL沙門菌菌液（50～100個/mL）作為試驗組，一瓶加入1 mL金黃色葡萄球菌菌液（50～100個/mL）作為陰性菌對照組；另取1瓶400 mL營養肉湯，加入1 mL沙門菌菌液（50～100個/mL）作為沙門菌陽性對照組。按沙門菌檢查法檢驗，結果見表6。

表6 沙門菌檢查結果

由表6可知，陰性對照組未檢出沙門菌，試驗組檢出沙門菌?？刹捎门囵B基稀釋法進行本品的沙門菌檢查。

3 討論

本品按《中國藥典》2010年版一部（附錄ⅩⅢC）微生物限度檢查法進行方法驗證，結果表明，用pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液制備樣品，可采用培養基稀釋法（1∶20供試液，0.1 mL/皿）進行細菌計數；采用培養基稀釋法（400 mL營養肉湯）進行沙門菌檢查；采用1∶10供試液的常規法進行霉菌及酵母菌計數和其他控制菌檢查。筆者曾采用薄膜過濾法進行試驗，但因供試品無法濾過，故選用培養基稀釋法。

[1]國家藥典委會.國家藥品標準《新藥轉正標準》[M].11冊.中國醫藥科技出版社，2011：43.

[2]徐愚聰，王野.熊膽粉的研究進展[J].華西藥學雜志，2000，15（3）：200-202.

[3]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄 79.

[4]顏棟林，李萍，蘭茜.柴黃片微生物限度檢查法方法驗證[J].中國當代醫藥，2009，16（16）：7.

[5]權明吉，金仁順，樸龍，等.熊膽粉對二甲基亞硝胺誘發大鼠肝纖維化的抑制作用[J].世界華人消化雜志，2005，13（20）：88.

[6]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：化學工業出版社，2005：附錄71.