復合誘變抗性篩選法選育高轉化甘油產1,3-二羥基丙酮菌株

戴 甄，張 波，王 剛，藍小玲，楊曉琴，魏 屹，李學如

(1.西南交通大學生命科學與工程學院，四川 成都 610031；2.四川省食品發酵工業研究設計院，四川 成都 611130)

1,3-二羥基丙酮(Dihydroxyacetone，DHA)是一種重要的醫藥化工中間體，在精細化工、食品、醫藥和化妝品等工業領域具有廣泛的應用前景[1～3]。目前，國外已實現了大規模工業化微生物發酵法生產DHA；國內在發酵法生產DHA菌株篩選和工藝優化方面也取得了很大進展，但與國外相比，還存在一定差距[4～6]。因此，篩選高產DHA菌株意義重大。

傳統物理和化學誘變法選育高產菌株存在作用目標不明確、有效突變率低、工作量大、篩選周期長等缺點，尋找快捷、高效篩選高產菌株的方法一直是工業微生物育種研究者的目標[7]。

Shima 等[8]于1996 年發現，在Streptomyceslividans核糖體S12 蛋白的編碼基因rpsL中引入某些點突變，可激活該菌株中沉默的抗生素生物合成基因，導致放線紫紅素的超量合成。隨后大量的研究表明，微生物獲得特定類型的抗性突變，不僅反映了其核糖體或RNA 多聚酶上相關靶位點結構的改變，也對突變菌株次級代謝產物的生物合成能力影響顯著[9，10]。由于這些突變與出發菌株獲得的藥物抗性有關，由此發展起來的抗生素抗性篩選技術，因其實驗操作簡便、效果顯著而在微生物菌株選育中得到廣泛應用。

作者在此以不動桿菌(Acinetobactersp.)Asp16為出發菌株，通過UV和60Co誘變結合鏈霉素抗性平板篩選，選育高轉化甘油產DHA菌株，并對誘變條件進行研究，擬為DHA的大規模工業化生產奠定基礎。

1 實驗

1.1 菌種與培養基

不動桿菌(Acinetobactersp.)Asp16，自行篩選獲得。

斜面和平板固體培養基(g·L-1)：甘油50.0，葡萄糖50.0，酵母膏10.0，碳酸鈣3.0，瓊脂18.0，pH值自然。

種子培養基(g·L-1)：甘油50.0，葡萄糖50.0，酵母膏10.0，碳酸鈣3.0，pH值自然。

發酵培養基(g·L-1)：甘油140.0，酵母膏5.0，碳酸鈣7.0，pH值自然。

1.2 試劑與儀器

二苯胺，1,3-二羥基丙酮，硫酸鏈霉素(Sigma 公司)。

LC-20AT型高效液相色譜儀，日本島津；V-1100D型可見分光光度計，上海美譜達；ZHWY211B型旋轉搖床,上海智城。

1.3 方法

出發菌株Asp16→分離純化→鏈霉素平板確定最低殺菌濃度→新鮮斜面菌種→菌懸液→UV/60Co誘變→鏈霉素平板分離→挑取單菌落→初篩、復篩→正突變菌株→突變株穩定性實驗→高產突變株。

(1)紫外(UV)誘變：將出發菌株接種在種子培養基中，過夜培養；轉接到新鮮培養基，培養至對數生長期，離心收集菌體，用生理鹽水洗滌2次后懸浮于生理鹽水中,調整菌體濃度為108個·mL-1左右；在距30 W紫外燈光源30 cm處照射一定時間；涂布于甘油含量為14%的鏈霉素固體培養基平板，30 ℃培養2～3 d；挑選單菌落進行搖瓶發酵實驗。

(2)γ-射線(60Co)誘變：分別以100～600 Gy輻射劑量對過夜培養的斜面試管中的菌體進行60Co照射，然后在甘油含量為14%的鏈霉素固體培養基平板上分離單菌落，30 ℃培養一定時間，挑選單菌落進行搖瓶發酵實驗。

(3)發酵種子培養：挑取一環新鮮斜面菌種，接種于裝有50 mL種子培養基的500 mL三角瓶中，于30 ℃、250 r·min-1搖床培養24 h，得到發酵用種子培養液。

(4)搖瓶發酵：按10%接種量將種子培養液接入裝有50 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中，于30 ℃、250 r·min-1搖床培養60 h，測定發酵液中DHA含量。

1.4 分析檢測

1.4.1 最低殺菌濃度的測定

取30 ℃搖瓶培養12 h的不動桿菌Asp16菌液0.1 mL，分別涂布于含不同濃度鏈霉素的培養基平板，30 ℃培養3 d。觀察平板上的菌落生長情況，以未長菌落的最低鏈霉素濃度作為最低殺菌濃度。

1.4.2 DHA含量測定

采用二苯胺顯色法[11]測定DHA含量：將發酵液離心除去菌體，取1 mL上清液置于500 mL容量瓶中定容，混勻；取1 mL稀釋液與9 mL顯色液(濃硫酸∶無水乙酸∶二苯胺=6 mL∶54 mL∶0.6 g)在比色管中混勻，沸水浴15 min，冷卻后，用分光光度計測定615 nm處吸光度，按標準曲線[10]計算對應的DHA含量。

HPLC色譜條件[6]：Alltima C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為5%甲醇的水溶液(加入0.05% H3PO4調pH值至3.0)；流速1.0 mL·min-1；柱溫25 ℃；進樣量10 μL；檢測波長200 nm。

2 結果與討論

2.1 DHA含量測定方法的確定

分別采用二苯胺顯色法和高效液相色譜法測定DHA含量，結果如表1所示。

表1 二苯胺顯色法和HPLC法測定的DHA含量比較

由表1可知，兩種方法測定的相關系數R2都在0.99以上，測得的DHA含量相近。可見，兩種方法都能比較精確地測定發酵液中DHA含量，尤其是二苯胺顯色法簡單、快捷，特別適合于菌株選育過程中大量樣品測定。

2.2 最低殺菌濃度

實驗發現，在鏈霉素濃度≥25 mg·L-1的培養基平板上未長出菌落。因此，確定鏈霉素濃度25 mg·L-1為菌株Asp16的最低殺菌濃度。

2.3 菌株的誘變與篩選

2.3.1 紫外誘變對Asp16正突變率的影響

取5 mL單菌體懸浮液于內置磁力攪拌子的無菌平皿中，置于30 W紫外燈下開蓋恒溫振蕩照射不同時間(20 s、30 s、40 s、50 s、70 s)，然后稀釋涂布鏈霉素平板，培養3 d后，隨機挑選40個單菌落，以Asp16為對照，搖瓶篩選?？疾熳贤庹T變時間對Asp16正突變率的影響，結果見表2。

表2 紫外誘變時間對Asp16正突變率的影響

由表2可知，隨著紫外誘變時間的延長，Asp16的正突變率先升高后降低；當紫外誘變時間為40 s時，Asp16的正突變率最高，達56.8%；當紫外誘變時間為70 s時，Asp16的正突變率降到30.4%。

2.3.260Co誘變對Asu95致死率的影響

用不同劑量的60Co誘變Asu95(Asp16紫外誘變40 s后的突變株)，鏈霉素平板分離，待菌落形成后，先進行菌落計數，計算致死率，然后各處理劑量隨機挑選50個單菌落，以Asu95為對照，經搖瓶篩選后，計算正突變率，結果見表3。

表3 60Co誘變劑量對Asu95致死率和正突變率的影響

由表3可知，在60Co誘變劑量為100～200 Gy時，致死率與誘變劑量成正比；在60Co誘變劑量為300～400 Gy時，致死率和正突變率變化不大。因此，從誘變育種規律上考慮，選擇逐漸減少60Co誘變劑量的方法。

2.3.3 復合誘變處理

將出發菌株Asp16按圖1進行誘變處理后，涂布鏈霉素平板分離；每次處理挑取150～200個單菌落，進行搖瓶初篩和復篩，獲得系列突變株，最終篩選出DHA高產突變株Asr168。

圖1 復合誘變處理過程

2.4 出發菌株與突變株產DHA的比較(表4)

表4 Asp16與突變株產DHA的比較

由表4可知，經UV和60Co誘變處理，并結合鏈霉素抗性平板篩選得到的Asr168產DHA達136 g·L-1，比出發菌株Asp16提高200%，發酵周期縮短了24 h，生產效率從15 g·L-1·d-1上升到68 g·L-1·d-1，提高近350%。這說明，UV和60Co誘變處理結合鏈霉素抗性平板篩選對提高DHA的生產效率是有效的；多次誘變具有明顯突變的效果，尤其以60Co誘變更為有效。同時，突變株比出發菌株的菌落大，淺黃色，為圓形，凸狀。

2.5 突變株的穩定性實驗

將選育出來的突變株Asr168進行斜面菌種傳代實驗，第1代、第3代、第6代、第10代的DHA產量(g·L-1)分別為135.0、136.8、135.5、134.0，連續傳代10 次，其DHA產量沒有顯著差異，均穩定在134.0 g·L-1以上。表明所獲得的突變株Asr168遺傳性能穩定，是產DHA的優良菌株,具有重要的工業應用價值。

3 結論

將UV和60Co誘變與鏈霉素抗性平板篩選技術結合，篩選獲得1株遺傳性能穩定、高轉化甘油產DHA的突變株Asr168，DHA產量達到136 g·L-1，較出發菌株Asp16提高200%。為實現工業化發酵生產DHA打下了堅實基礎。

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