響應面法優化達托霉素發酵培養基的研究

宇光海，尹艷麗，張 垚

(河南工業大學生物工程學院生物工程系,河南 鄭州 450001)

達托霉素(DAP)屬于A21978C家族，是一種含有13個氨基酸的大環脂肽類抗生素，在玫瑰孢鏈霉菌中以非核糖體蛋白合成酶(Non-ribosomal peptide synthetase,NRPS)機制合成，具有依賴于Ca2+破壞病菌細胞膜的新型作用，因此對許多耐藥病菌具有顯著的治療作用[1～4]。達托霉素具有在體外抗絕大多數臨床革蘭氏陽性菌的作用，對于一些可選擇的抗生素很少的耐藥菌，如耐萬古霉素的腸球菌(VRE)、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)、糖肽類敏感的金黃色葡萄球菌(GISA)、凝固酶陰性的葡萄球菌(CNS)和耐青霉素的肺炎鏈球菌(PRSP)等的感染具有有效的殺菌和抑菌效果[5]。達托霉素2003年被FDA批準用來治療由革蘭氏陽性菌引起的皮膚和皮膚結構感染,2006年被FDA批準用來治療由革蘭氏陽性菌引起的菌血癥和由耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)引起的右側心內膜炎[5]。因此，達托霉素已成為21世紀最具潛力和應用價值的抗生素之一，其醫學價值、社會影響力與日俱增，市場前景廣闊。但仍存在產量低、成本高的問題。因此，提高達托霉素的產量迫在眉睫。

發酵培養基的組成對于目的產物的形成有著顯著的影響。對發酵培養基進行優化，可以顯著提高目的產物產量[6，7]。近年來培養基優化方法已經由傳統的耗時耗力的非統計優化方法逐漸發展為統計優化方法，其中最為常用的是Plackett-Burman 設計、最陡爬坡設計與響應面設計相結合的優化方法。Plackett-Burman 設計從多種因素中篩選出主要影響因子[8]，最陡爬坡設計使主要因子的水平接近響應面最大值，響應面設計最后確定因素的最優值[9]。該優化方法已廣泛應用于工程設計、生物醫藥等領域，并取得了良好的效果[10]。

作者在此采用Plackett-Burman 設計、最陡爬坡設計與響應面設計相結合的優化方法對達托霉素的發酵培養基進行優化，以提高達托霉素的產量。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

達托霉素標準品，大連美倫生物技術有限公司；乙腈、甲醇為色譜純；其它試劑均為分析純。

1200型高效液相色譜儀，美國Agilent公司。

1.2 菌種與培養基

玫瑰孢鏈霉菌(Streptomycesroseosporus)GC-68是StreptomycesroseosporusNRRL11379的自然篩選突變株，自行保藏。

高氏一號培養基(斜面固體培養基，g·L-1)：可溶性淀粉 20，KNO31，MgSO40.5，K2HPO40.5，NaCl 0.5，FeSO40.01，瓊脂粉 20，加蒸餾水定容至100 mL，pH值7.2～7.4。

種子培養基(g·L-1):可溶性淀粉 20，KNO31，MgSO40.5，K2HPO40.5，NaCl 0.5，FeSO40.01，加蒸餾水定容至100 mL，pH值7.2～7.4。

基礎發酵培養基(g·L-1)：葡萄糖 7.5，糊精 10，可溶性淀粉 10，蛋白胨 8.5，酵母浸粉 6，干酪素 8.5，L-天冬氨酸 1，谷氨酸 0.5，MgSO40.5，K2SO40.5，K2HPO40.5，pH值7.2～7.4。

1.3 方法

將分離后的菌株接種于高氏一號培養基中，于30 ℃、濕度40%的條件下培養7 d；將斜面種子接種于已滅菌的種子培養基中，于30 ℃、220 r·min-1培養48 h左右；取1 mL種子培養液接種于設計的發酵培養基中，于30 ℃、220 r·min-1搖床發酵7 d(48 h時加入0.2 g·L-1正癸酸)，測定菌體生長量和達托霉素產量，以確定最優的培養基組成。

1.4 分析與檢測

菌體生長量的測定采用干重法[11]。

達托霉素產量的測定采用HPLC法[11]：分析柱為反相ODS柱，流動相為含0.1%三氟乙酸的乙腈-水(45.5∶54.5，體積比)，流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃，柱壓8～9 MPa，檢測波長220 nm。

實驗數據分析采用Design expert 7.0軟件。

2 結果與討論

2.1 Plackett-Burman設計

根據單因子實驗結果(數據未顯示)，并結合玫瑰孢鏈霉菌菌體生長和發酵的特點，選取11個因素(包括不同的碳源、氮源和微量元素)，根據基礎發酵培養基成分分別選擇一個高水平、一個低水平，進行Plackett-Burman設計實驗，考察培養基中的11個因素對達托霉素產量的影響，結果見表1。

表1 Plackett-Burman設計實驗結果/g·L-1

對表1數據進行方差分析，結果見表2。

由表2可知，除變量C、D、G的Prob>F值小于0.05外，其它變量的Prob>F值均大于0.05。說明在Plackett-Burman設計中，變量C、D、G顯著，而其它變量不顯著[12]。表明變量C、D、G的模型貢獻率較大，是構建模型的主要影響因素。運用Design expert 7.0軟件對Plackett-Burman設計結果進行回歸分析，得到關于響應面的多元一次方程：DAP=233.17778+0.53333A-1.39167B-9.56000C-5.35333D-2.30000E+7.35556F-28.00000G，作為主要影響因素的變量C、D、G在多元一次方程中的系數都為負值，表明它們在模型中的影響均為負效應，在后續的最陡爬坡設計中均需降低這些因素的實際濃度水平。

2.2 最陡爬坡設計

在Plackett-Burman設計得到的多元一次方程的基礎上，根據其系數的正負及大小，設計主要因素C、D、G的最陡爬坡實驗，選擇合適的上升路徑和步長，得出峰值，從而逼近其最大響應區域，為下一步的響應面設計做準備[12]。其它次要因素均依照其在方程中系數的正負分別取Plackett-Burman設計編碼值的高水平或低水平。最陡爬坡設計實驗結果見表3。

由表3可知，3#實驗的達托霉素產量最高，達176.85 mg·L-1。故以3#實驗培養基配方作為響應面設計中心點。

表2 Plackett-Burman設計實驗方差分析

表3 最陡爬坡設計實驗結果

2.3 響應面設計

以最陡爬坡設計得到的培養基配方為中心點，運用Design expert 7.0軟件的Box-Behnken設計，針對主要因素C、D、G的濃度使用中值組合重新編碼，以達托霉素的產量為響應值，設計3因素3水平的響應面設計實驗[13]，其因素與水平見表4。

表4 Box-Behnken設計實驗的因素與水平

糊精、可溶性淀粉和L-天冬氨酸的濃度水平如表4所示，其它次要因素均取最低水平，進行Box-Behnken設計實驗，結果見表5。

表5 Box-Behnken設計實驗結果

使用Design expert 7.0軟件對表5數據進行方差分析，結果見表6。

表6 Box-Behnken設計實驗的回歸方程分析和方差分析

R2=0.9636，R2(adj)=0.9267

由表6可知，模型Prob>F值小于0.001,說明模型極為顯著；變量A′、B′的Prob>F值小于0.001，極為顯著；變量C′顯著(Prob>F值小于0.05)；交互項A′C′極為顯著(Prob>F值小于0.01)；虛擬變量不顯著。說明此模型選擇較為合理，分析結果較為可靠。回歸方程的決定系數R2=0.9636,說明96.36%的實驗數據可由回歸方程解釋，因此可用模型代替真實實驗點進行數據分析。回歸使用3-D Surface繪制響應面三維曲線，如圖1所示。

圖1 各因素交互作用響應面圖

由圖1可知，此響應面的最高點在設計的模型范圍之內，說明此響應面的變量設計較好，可以進行后續分析以求得響應值最高點。

對實驗結果進行二次回歸，得到響應值擬合方程：DAP=180.20+0.037A′-1.63B′-1.76C′+5.03A′B′+1.05A′C′+2.98B′C′+2.20A′2-2.77B′2-0.45C′2，R2=0.9428。

利用軟件的Numerical optimization 功能預測響應值最大值，模型各因素的組合為糊精7.0 g·L-1、可溶性淀粉6.66 g·L-1、L-天冬氨酸0.4 g·L-1,達托霉素最大產量預測值為186.0 mg·L-1。

2.4 驗證實驗

為了驗證Design expert 7.0軟件分析和預測結果的可信度，以預測響應值的最大值所對應的培養基組成為配方進行實驗，同時以基礎發酵培養基作對照，結果見圖2。

圖2 優化前后菌體生長及達托霉素產量

由圖2可知，優化前后，培養基中各組分含量的變化對菌體生長的影響不太顯著,但優化后穩定期菌體的干重明顯升高。穩定期是達托霉素的主要合成時期，高的菌體濃度有利于達托霉素的合成，因此，由圖中曲線可以看到，培養基優化后，達托霉素的產量顯著上升，由優化前的106.7 mg·L-1最高可升到185.3 mg·L-1，提高了73.7%。這可能是由于，優化后的培養基使達托霉素合成和菌體生長有更好的平衡關系，使底物抑制作用降低，同時可以更好地為達托霉素的合成提供前體物質。

3 結論

采用Plackett-Burman 設計、最陡爬坡設計與響應面設計相結合的優化方法，使用Design expert 7.0軟件對實驗結果進行分析，得到了達托霉素的優化培養基中糊精、可溶性淀粉、L-天冬氨酸的濃度分別為7.0 g·L-1、6.66 g·L-1、0.4 g·L-1，在此條件下，達托霉素的產量達到185.3 mg·L-1，比優化前的106.7 mg·L-1提高了73.7%。

參考文獻：

[1] Canepari P，Boaretti M，Lleó M M，et al.Lipoteichoic acid as a new target for activity of antibiotics：Mode of action of daptomycin(LY146032)[J].Antimicrob Agents Chemother，1990，34(6)：1220-1226.

[2] Enoch D A，Bygott J M，Daly M L，et al.Daptomycin[J].J Infect，2007，55(3)：205-213.

[3] Jeu L，Fung H B.Daptomycin：A cyclic lipopeptide antimicrobial agent[J].Clin Ther，2004，26(11)：1728-1757.

[4] Walsh C T，Fischbach M A.Natural products version 2.0：Connecting genes to molecules[J].J Am Chem Soc，2010，132(8)：2469-2493.

[5] Sauermann R，Rothenburger M，Graninger W，et al.Daptomycin: A review 4 years after first approval[J].Pharmacology,2008，81(2)：79-91.

[6] Tanyildizi M S，Ozer D,Elibol M.Optimization ofα-amylase production byBacillussp.using response surface methodology[J].Process Biochem，2005，40(7):2291-2296.

[7] Tari C，Genckal H，Tokatli F.Optimization of a growth medium using a statistical approach for the production of an alkaline protease from a newly isolatedBacillussp.L21[J].Process Biochem，2006，41(3)：659-665.

[8] Miller A，Sitter R R.Using the folded-over 12-run Plackett-Burman design to consider interactions[J].Technometrics，2001，43(1)：44-54.

[9] Myers R H.Response surface methodology：Current status and future directions[J].J Qual Technol，1999，31(1):30-44.

[10] Bezerra M A，Santelli R E，Oliveira E P，et al.Response surface methodology(RSM) as a tool for optimization in analytical chemistry[J].Talanta，2008，76(5)：965-977.

[11] 盧文玉，聞建平，范晶華，等.癸酸抗性突變株流加發酵法生產達托霉素[J].天津大學學報，2006，39(B06)：20-24.

[12] Chen Xiao-Chun，Bai Jian-Xin，Cao Jia-Ming，et al.Medium optimization for the production of cyclic adenosine 3′，5′-monophosphate byMicrobacteriumsp.no.205 using response surface methodology[J].Bioresource Technology，2009，100(2)：919-924.

[13] Muralidhar R V，Chirumamila R R，Marchant R，et al.A response surface approach for the comparison of lipase production byCandidacylindraceausing two different carbon sources[J].Biochem Eng，2001，9(1):17-23.