應用流式細胞儀進行CHO細胞計數及存活率計算

高 茜，管 瑩，米其利，李雪梅，繆明明，夭建華

(云南煙草科學研究院,云南 昆明 650106)

中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cell，CHO cell)因其生長快、易培養等特性，被廣泛應用于生物工程和多種化學物質的毒理學評價[1～3]。對于CHO工程細胞的懸浮培養而言，細胞密度與存活率是影響細胞生長和細胞表達產物的重要因素之一[4，5]；而在毒理學評價實驗如中性紅細胞毒性實驗中，接種的細胞密度對實驗定量結果也有較大的影響[6]。因此，在大規模的細胞實驗中需要快速準確地進行細胞計數及細胞存活率計算。

傳統的血球計數板法易受操作細節影響，精確性得不到保證，并且費時費力。流式細胞儀法由于具有快速定量的特點，近年來在多種生物學實驗如細胞周期測定、細胞凋亡檢測、細胞分選中都得到應用，但流式細胞儀在細胞計數方面的應用主要是定性地分辨血液細胞中不同標記的細胞比例[7，8]，而對CHO工程細胞的定量細胞計數卻未見報道。作者在此應用流式細胞儀進行細胞計數及存活率計算，以期為CHO細胞的蛋白生產及化學品的毒理學評價提供依據。

1 實驗

1.1 細胞、試劑與儀器

中國倉鼠卵巢細胞，中國科學院昆明細胞庫。

DMEM/F12細胞培養液、PBS、胎牛血清，美國Giboco公司；胰蛋白酶，美國Invitrogen公司；PI(碘化丙啶染色劑)，美國Sigma公司；臺盼藍，上海索來寶公司。

流式細胞儀(Cell Lab Quanta SC High Resolution Flow Cytometry)、流式管，Beckman Coulter公司；CO2培養箱，Thermo公司；二級生物安全柜，Heal Force公司；TS100-F-HMC型倒置顯微鏡，Nikon公司；細胞培養瓶，美國Corning公司；XS204型分析天平(感量0.0001 g)，Mettler Toledo公司；DT5-5型離心機，北京時代北利離心機有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CHO細胞的培養及處理

在37 ℃水浴中復蘇CHO細胞，之后接種到細胞培養瓶中。用DMEM/F12細胞培養液(含10%胎牛血清)在5% CO2、37 ℃的細胞培養箱中培養。待細胞匯合率達到80%，用胰蛋白酶消化細胞為單細胞懸液，用PBS洗滌并離心后進行細胞計數。部分細胞用70%乙醇固定30 min，再用PBS洗滌后進行細胞計數。

1.2.2 應用流式細胞儀進行細胞計數與細胞存活率計算

用移液槍將500 μL細胞懸液移至流式管中，加入5 μL 1 mg·mL-1PI，輕輕吹打均勻后避光染色5～10 min，放入流式細胞儀進樣位置。打開流式細胞儀，第一次計數時選擇Counting程序，根據實際情況調節電子體積(EV)及側向散射光(SS)的值使細胞群位于合適的位置，并分別調節EV圖及SS圖中Counting的范圍去除碎片干擾，再根據PI的熒光強度(FL3)設定死活細胞范圍，并保存程序為CHO cell counting。以后計數時選擇CHO cell counting程序來讀取數據。細胞計數為SS圖的統計值，細胞存活率為FL3圖的統計值。

1.2.3 應用血球計數板進行細胞計數與細胞存活率計算

將計數板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數板上。用移液槍將50 μL細胞懸液移至離心管中，加入50 μL 0.1%臺盼藍染液，染色3 min后將待測細胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入。將血球計數板置于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數板，當看到鏡中出現計數方格后，數出四角的4個大格(每個大格含有16個中格)中的細胞數及被染液染上色的細胞數。按下式計算細胞懸液的細胞濃度及細胞存活率：

2 結果與討論

2.1 建立流式細胞儀進行CHO細胞計數與細胞存活率計算的方法

流式細胞儀是根據EV和SS2個參數來識別CHO細胞的，由于不同細胞的大小和性質不同，要根據不同的細胞調整EV與SS的Gain值以使細胞易于分析。設置EV=0.16、SS=3.6，CHO細胞經流式細胞儀檢測后得到的流式散點圖如圖1所示。

圖1 流式細胞儀檢測CHO細胞散點圖(SS/EV)

由圖1可以看出，消化的CHO細胞分散狀況良好，大部分都是單細胞狀態。

由于細胞在消化處理的過程中會受到一定的損傷，并且存在一些未消化完全的細胞團，為了排除這些因素的影響，分別設定SS及EV2個參數的范圍以更精確地進行細胞計數。通過SS參數和EV參數去除細胞碎片、細胞團及細胞懸液中的雜質的直方圖見圖2。

圖2 CHO單細胞范圍直方圖

PI(碘化丙啶)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但能夠透過死細胞和凋亡細胞的細胞膜，在488 nm激發光下使細胞核紅染[9]。因此，可用PI作為計算細胞存活率的染料，熒光強度低的為活細胞，熒光強度高的為死細胞。CHO細胞的PI著色直方圖見圖3。

圖3 未處理(a)和70%乙醇處理(b)CHO細胞的PI著色直方圖

由圖3可以看出，未處理CHO細胞的PI著色圖的峰值范圍主要在100～102熒光范圍內；70%乙醇處理后的CHO細胞的PI著色圖的峰值范圍主要在103～104熒光范圍內。因此，可根據這兩個區域分別劃定活細胞及死細胞的范圍從而計算細胞存活率。

2.2 兩種方法細胞計數結果比較

用流式細胞儀和血球計數板分別對CHO細胞進行計數，每種計數方法計數3次并計算均值與SD值，結果見表1。

表1 流式細胞儀法與血球計數板法計算的細胞濃度

由表1可看出，流式細胞儀法計算結果與CHO細胞稀釋梯度一致，并且SD值較低，重復性好；血球計數板法計算結果雖然也有一定的梯度，但與細胞稀釋梯度并不完全吻合，SD值也較高，計算結果重復性較差，需要多次計數才能獲得比較準確的結果。

為了進一步研究流式細胞儀法是否能替代血球計數板法進行細胞濃度計算，對兩種方法的相關性進行分析，結果見圖4。

圖4 流式細胞儀法與血球計數板法計算的細胞濃度相關性分析

由圖4可以看出，兩種方法的相關系數R2=0.9341，表明相關性較好。

2.3 兩種方法細胞存活率計算結果比較

用流式細胞儀和血球計數板分別對CHO細胞進行存活率計算，每種方法計算3次并計算均值與SD值，結果見表2。

表2 流式細胞儀法與血球計數板法計算的細胞存活率

由表2可以看出，流式細胞儀法計算的存活率結果與CHO細胞處理方式一致，并且SD值較低，重復性好；血球計數板法計算結果雖然也與CHO細胞處理方式基本吻合，但SD值較高，重復性較差，需要多次分析才能獲得比較準確的結果。

為了進一步研究流式細胞儀法是否能替代血球計數板法進行細胞存活率計算，對兩種方法的相關性進行分析，結果見圖5。

圖5 流式細胞儀法與血球計數板法計算的細胞存活率相關性分析

由圖5可以看出，兩種方法的相關系數R2=0.971，表明相關性很好。

3 結論

(1)應用流式細胞儀進行細胞計數和存活率計算的關鍵為SS值限制、EV值限制、FL3范圍劃定3個步驟。通過SS值限制和EV值限制計算細胞濃度，通過FL3范圍劃定計算細胞存活率。

(2)應用流式細胞儀計算的細胞濃度及細胞存活率數據準確可靠，重復性好，具有快速穩定的特點。因此，在大規模的細胞實驗中，可以用流式細胞儀法替代血球計數板法對細胞狀態進行分析。

參考文獻：

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[2] Jayapal K P，Wlaschin K F，Hu W S，et al.Recombinant protein therapeutics from CHO cells——20 years and counting[J].Chemical Engineering Progress，2007，103(10):40-47.

[3] 夭建華,陳輝敏,方力,等.國內外卷煙危害性評價方法現狀和發展趨勢[J].煙草科技,2007,(1):50-53.

[4] Wei Y Y，Naderi S，Meshram M，et al.Proteomics analysis of Chinese hamster ovary cells undergoing apoptosis during prolonged cultivation[J].Cytotechnology，2011，63(6):663-677.

[5] 高茜,管瑩,曾婉俐,等.體外連續傳代培養對生物工程細胞CHO凋亡的影響[J].化學與生物工程,2012，29(5):26-30.

[6] 管瑩,夭建華,高茜,等.CHO細胞初始接種密度對細胞毒性試驗結果的影響[J].化學與生物工程,2012，29(9)：39-42.

[7] 萬歲桂,趙弘,徐娟,等.校正后的流式細胞術原始細胞計數在骨髓增生異常綜合征分型診斷中的應用[J].內科急危重癥雜志,2011,17(4):213-215.

[8] 萬歲桂,趙弘,徐娟,等.流式細胞術CD34+細胞計數在骨髓增生異常綜合癥分型診斷中的作用[J].標記免疫分析與臨床,2011,18(5):308-311.

[9] 陳必成,夏鵬,楊麗紅,等.兩種熒光染料——CFSE與碘化丙啶染色方法檢測細胞殺傷能力[J].中華微生物學和免疫學雜志,2006,26(2):192.