HPLC法測(cè)定大黃提取物中蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量

閆海燕

(寶雞文理學(xué)院 陜西省植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 寶雞 721013)

大黃(RheumpalmatumL.)為蓼科植物掌葉大黃、唐古特大黃和藥用大黃的干燥根及根莖，是一種多年生草本植物，其主要藥用成分為蒽醌類(lèi)衍生物[1]。作者建立了同時(shí)測(cè)定大黃提取物中蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的高效液相色譜法，擬為該藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

馬蹄大黃，寶雞方晟藥業(yè)公司。

蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品，純度>98%，天津馬克生物技術(shù)有限公司；甲醇為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

Agilent 1200型高效液相色譜儀，美國(guó)；CP225D型電子分析天平，德國(guó)Sartorius；KQ-300VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器。

1.2 色譜條件

色譜柱：Prontosil-C18-ace-Eps(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(90∶10，體積比)，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.3 對(duì)照品溶液的配制

精密稱(chēng)取適量蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品，加甲醇定容至刻度，分別配制成32.6 μg·mL-1、65.0 μg·mL-1、49.6 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，備用。

1.4 供試品溶液的制備

稱(chēng)取0.5 g生藥大黃粉末，精密稱(chēng)定，加入甲醇25 mL，加熱回流30 min，放冷，濾過(guò)，取濾液5 mL蒸干，殘?jiān)?%鹽酸溶液10 mL，超聲提取2 min，再加氯仿10 mL，加熱回流1.5 h，放冷，置分液漏斗中，用少量氯仿洗滌容器也置于分液漏斗中，分取氯仿層，酸液再用氯仿提取3次，每次10 mL，合并氯仿液，減壓回收氯仿，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中定容。搖勻，濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液。

1.5 線性關(guān)系考察

精密移取蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚混合對(duì)照品溶液，按1.2色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積(y)為縱坐標(biāo)、對(duì)照品濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸。

1.6 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一濃度混合對(duì)照品溶液，在相同色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20 μL，分別測(cè)定峰面積。

1.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一供試品溶液，按1.2色譜條件分別于室溫下第0 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣測(cè)定。

1.8 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

分別精密稱(chēng)取大黃粗粉6份并制成供試品溶液，按1.2色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。

1.9 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量大黃粗粉0.5 g，分別加入蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，制成供試品溶液，按1.2色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。

1.10 樣品含量測(cè)定

精密稱(chēng)取大黃粗粉0.5 g，制成供試品溶液，按1.2色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)照品與供試品的HPLC圖譜(圖1)

1.蘆薈大黃素 2.大黃酚 3.大黃素甲醚

2.2 線性回歸方程及線性范圍(表1)

表1 線性回歸方程及線性范圍

2.3 精密度

精密度實(shí)驗(yàn)中，蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.60%、0.76%、0.27%(n=6)。表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD分別為0.94%、1.36%、1.23%(n=5)。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重現(xiàn)性

重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)中，蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD分別為1.36%、0.96%、1.96%(n=6)。表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.6 加標(biāo)回收率

測(cè)定結(jié)果表明，蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均加標(biāo)回收率分別為115.5%、98.1%、99.9%。

2.7 樣品含量

測(cè)定結(jié)果表明，產(chǎn)自甘肅的馬蹄大黃中蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量分別為0.66 mg·g-1、1.98 mg·g-1、2.61 mg·g-1。

2.8 討論

以往文獻(xiàn)常用酸性水-甲醇[2]、TFA-HCN系統(tǒng)為流動(dòng)相[3]。本研究采用甲醇-水為流動(dòng)相，操作簡(jiǎn)便，出峰快，峰形對(duì)稱(chēng)，分離度高且實(shí)驗(yàn)后色譜柱易清洗，取得了滿(mǎn)意效果。

3 結(jié)論

建立了同時(shí)測(cè)定大黃提取物中蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的HPLC方法。結(jié)果表明，蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚分別在1.3～10.4 μg·mL-1、1.3～6.5 μg·mL-1、3.0～12.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2分別為0.9997、0.9999、0.9992，平均加標(biāo)回收率分別為115.5%、98.1%、99.9%。該方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，可用于大黃提取物的質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)：

[1] 徐翔，酈柏平,張慧芬.大黃的研究進(jìn)展[J].上海中醫(yī)藥雜志，2003，37(4)：56-59.

[2] 徐世霞.HPLC法測(cè)定枳實(shí)導(dǎo)滯丸中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚的含量[J].中國(guó)藥師，2011，14(7)：971-973.

[3] 鄭志華,祝晨蔯.HPLC法測(cè)定大黃提取物中5種蒽醌的含量[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，20(6)：594-595.