槲皮素固體脂質納米粒體外釋放度考察

肖 琴 陳 芳 常明泉 王 剛

湖北醫藥學院附屬醫院，湖北 十堰 442000

固體脂質納米粒（solid lipid dnanopartcles，SLN）系指以生理相容性的高熔點脂質為骨架材料制備而成的納米粒。該制劑具有細胞親和性、靶向性、緩釋性、低毒性和穩定性的特點，制成脂質體的藥物其生物利用度可獲得大幅度提高[1-3]。槲皮素固體脂質納米粒是一種以山崳酸甘油酯、膽固醇、大豆卵磷脂為載體材料，以丙酮-三氯甲烷（1∶1）為混合溶劑，以槲皮素為主藥，吐溫-80為乳化劑，采用熔融-勻化法制備而成的一種抗癌制劑，該制劑主要通過槲皮素對細胞的增殖作用及對血管的新生作用而對腫瘤細胞產生抑制和預防作用，從而達到抗癌目的[4-5]。考察脂質體的體外釋放度對優化處方結構、篩選制備工藝及合理用藥具有指導意義。本實驗擬用透析袋-高效液相色譜法對槲皮素固體脂質納米粒的體外釋放度進行考察。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

RCZ-1A型溶出試驗儀（上海黃海藥檢儀器廠，220 V，50 Hz）；戴安3000型高效液相色譜儀（美國戴安公司）；分析天平（精度0.000 1 g）；透析袋（上海源葉生物科技公司，MWCO 7000，22 mm×1 m）；TGL-16G 離心機（上海安亭科學儀器廠）；UPS-200H 型超聲波震蕩儀（500 W，50 Hz，南京熊貓電子儀器有限公司）；LG-冰箱（LTR-B2071GTBC）。

1.2 試藥

槲皮素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100081-200406）；生理鹽水（安徽豐原淮海制藥有限公司，批號：20111011）；槲皮素固體脂質納米粒（太和醫院自制，批號：20120323）；甲醇為色譜純；無水乙醇、乙酸均為分析純。

2 方法與結果

2.1 系統適用性[6]

色譜柱：迪馬 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-4.3%乙酸溶液（55∶45）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；進樣量：20 μL；柱溫：30℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素對照品20.0 mg，置100 mL容量瓶中，先加無水乙醇約50 mL超聲震蕩溶解，再加無水乙醇至刻度，搖勻，即得200 μg/mL對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取樣品1 g，置適宜燒杯中，加入無水乙醇約15 mL超聲震蕩，直至破乳分散均勻后將溶液轉入50 mL量瓶中，用無水乙醇分3次洗滌燒杯，每次10 mL，洗液并入量瓶中，定容，搖勻，取溶液適量，在離心機中離心15 min，轉速1.0×104r/min，取上清液用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，取續濾液即得（該溶液在 5～10℃的冰箱中保存）。

2.2.3 空白溶液的制備 精密稱取不含槲皮素的固體脂質納米粒樣品1 g，按上述供試品溶液的制備方法制備，即得。

2.3 干擾試驗

分別取“2.2”項下的各溶液，參照“2.1”項下色譜條件將溶液各進樣20 μL，記錄色譜圖，結果對照品溶液、供試品溶液在相同時間內有同樣色譜峰出現，空白溶液無色譜峰出現，說明該脂質體中的其他成分對主藥含量測定無干擾。見圖1。

2.4 線性關系考察

分別精密吸取“2.2”項下的槲皮素對照品溶液（200 μg/mL）1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 及 10.0 mL，置 10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度， 即得 20.0、40.0、80.0、120.0、160.0、200.0 μg/mL的各溶液，各溶液按照“2.1”項下色譜條件分別進樣3次，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，進行線性回歸，得曲線方程為 A=1.343 5C-1.490 4（r=0.999 6），提示槲皮素在 20.0～200.0 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.5 精密度試驗

取“2.2”項下的對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件分別進樣6次，記錄峰面積，計算平均值，RSD為0.79%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取“2.2”項下的對照品溶液，在冰箱中保存（5～10℃），于0、4、12、24、36、48 h 分別取樣，按照“2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，計算平均含量為198.8 μg/g，RSD為1.38%。提示槲皮素溶液在低溫條件下48 h內穩定。

2.7 重復性試驗

精密稱取樣品6份，每份1 g，按“2.2”項下供試品溶液的制備方法制備溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣，測得槲皮素平均含量為 100.9 μg/g，RSD=1.29%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已測知含量的樣品（批號：20120323）6份，各0.5 g，分別加入濃度為 80 μg/mL 對照品溶液 1 mL，按“2.2”項下供試品溶液的制備方法制備溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，計算槲皮素回收率，結果見表1。

2.9 體外釋放度考察[7-8]

精密稱取槲皮素固體脂質納米粒10 g，置直徑為22 mm、長約10 cm的透析袋中，除去袋內空氣，兩頭用線繩扎緊，盤繞固定于溶出儀攪拌槳上，將攪拌槳置于距溶出杯底約1.5 cm處，以生理鹽水500 mL為釋放介質，保持溫度（37.0±0.5）℃，攪拌槳轉速至 50 r/min，分別 0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、36.0、48.0 h定時取樣2 mL（同時補加同體積的釋放介質），用 0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，按照“2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，計算出各時間槲皮素的累計釋放百分率，以釋放率為縱坐標，時間為橫坐標，用Excel擬合釋放曲線，結果見圖2。

表1 槲皮素固體脂質納米粒加樣回收率試驗結果（n=6）

圖2 槲皮素固體脂質納米粒體外累積釋放度曲線

結果槲皮素固體脂質納米粒中的槲皮素在48 h時累積釋放率為95.6%，具有顯著的緩釋特性。

3 討論

SLN的制備主要有熔融-勻化法、冷卻-勻化法、納米乳化法及薄膜超聲法。根據各藥物的性質及臨床用途選用適宜方法，藥物制成SLN后具有物理穩定性高、藥物泄露少、緩釋性好、低毒性、易于規模生產的特點。槲皮素固體脂質納米粒系采用熔融-勻化法制備而成。該制劑以山崳酸甘油酯、膽固醇、大豆卵磷脂為載體材料，上述3種包材均為疏水性載體材料，這些材料在乳化冷卻過程中形成網狀骨架結構，槲皮素溶液以分子狀態分散于骨架內保持穩定狀態，在模擬人體溫度和適度運動狀態條件下（50 r/min）脂質體被軟化，藥物的釋出必須首先通過載體材料的網狀骨架擴散，從而形成緩釋效應[9]。

流動相以甲醇-4.3%乙酸溶液（55∶45）組成，含量測定時洗脫分離效果好[10]。槲皮素的分子量為338.27，在選用透析袋時，考慮到脂質體的基質具有一定的黏度，可能對藥物向外釋放產生阻滯作用，故選用截留分子量較大的CE透析袋（MWCO 7000），以使在透析過程中藥物能夠充分釋出。

實驗結果顯示，槲皮素固體脂質納米粒中的槲皮素48 h內累積釋放率為95.6%，說明該脂質體具有良好的緩釋特性。應用透析袋-高效液相色譜法考察槲皮素固體脂質納米粒的體外釋放度操作便利，方法穩定，結果重復性好。

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