5b對人乳腺癌耐藥細胞株MCF-7ADR的耐藥逆轉作用

郭 榮 趙 瑛

山西醫科大學第一醫院醫院普通外科,山西太原 030001

臨床上，乳腺癌是一種女性常見的疾病，且發病率有逐年上升的趨勢。乳腺癌細胞中存在大量的多藥耐藥細胞株(MDR)，MDR能顯著降低化療藥物的敏感性，影響化療的治療效果[1]。板藍根是菘藍的根，其提取出來的活性物質具有較強的免疫激活功能，能顯著增強化療藥物阿霉素等的敏感性，增加化療藥物在癌細胞中的蓄積，提高藥效，而且其對細胞的毒副作用小。本文主要研究板藍根提取物5 b對乳腺癌耐藥細胞株MCF－7ADR的耐藥逆轉作用及逆轉機理，為乳腺癌的治療提供依據。

1 儀器及細胞株

1.1 儀器來源

活性單體－5 b為天津中醫藥大學提供，主要采用溶劑浸提法從中藥板藍根中分離提純獲得，純度高達98%。阿霉素及碘化吡啶由北京中山醫藥公司提供；1640細胞培養基、流式細胞儀由上海明治公司提供；CO2培養箱及顯微鏡由北京生物公司提供。

1.2 細胞株來源

人乳腺癌細胞株MCF－7及其耐藥細胞株MCF－7/ADR由中山腫瘤醫院實驗室提供，MCF－7/ADR細胞株的耐藥倍數是MCF－7細胞株的80倍。

2 實驗方法

2.1 細胞培養

MCF－7細胞及MCF－7/ADR細胞采用DMEM培養液在1640細胞培養基中培養，培養液中有100U/mL的鏈霉素、100U/mL的青霉素、12%的小牛血清；培養環境中有5%的CO2、保持在37℃左右、濕度適宜，2d進行一次傳代。

2.2 MTT法檢測[2]

本研究采用MTT法檢測活性單體－5 b對 MCF－7細胞及MCF－7/ADR細胞生長的安全濃度，并觀察MCF－7/ADR的多藥耐藥細胞株MDR生長的抑制功能及逆轉作用。耐藥倍數及逆轉倍數根據以下公式確定：耐藥倍數＝IC50(MCF－7/ADR細胞株)/IC50(MCF－7細胞株)，本研究中MCF－7/ADR細胞株的耐藥倍數是MCF－7細胞株的80倍；逆轉倍數＝IC50(阿霉素作用組)/IC50(活性單體－5b與阿霉素作用組)。

2.3 FCM法檢測[3]

本研究采用FCM 法檢測MCF－7細胞及MCF－7/ADR細胞的凋亡率，并觀察細胞中阿霉素的含量。細胞中阿霉素含量的測定方法：蒽環類藥物一般都會發出熒光，可以采用流式細胞儀對細胞中阿霉素的含量進行測定。選取106個對數生長期的細胞,加入2.4 mg/L的活性單體－5 b以及5 μmol/L的阿霉素，在 37℃的保溫箱中保溫1 h，將細胞收集后調整轉速為1500 rpm進行2 min的離心處理，采用新的DMEM培養液對細胞進行清洗；再放入37℃保溫箱中進行10 min左右的保溫，再次采用新的DMEM培養液對細胞進行清洗，放在新的、冰冷的DMEM培養液中使用488nm的激發光對細胞的熒光強度進行檢測。

3 統計學處理

本研究采用SPSS 17.0軟件包對數據進行統計學處理，采用Cell Quest Plot軟件對細胞數目進行計量，組間均數比較t檢驗。P＜0.05時，數據差異具有統計學意義。

4 結果

4.1 MTT法檢測結果

采用 MTT法檢測發現，在MCF－7細胞及 MCF－7/ADR細胞中加入低于150μmol/L的活性單體－5 b時，活性單體－5 b對兩種細胞均無毒副作用。IC50（MCF－7 細胞）＝（0.14±0.02），IC50（MCF－7/ADR 細胞）＝（15.74±0.08）,耐藥倍數均為 112。將 2 種細胞加入150μmol/L以下濃度的的活性單體－5 b中培養48 h后，MCF－7細胞及MCF－7/ADR細胞的IC50均有不同程度的下降，但MCF－7/ADR細胞的IC50下降更為明顯，逆轉倍數增高明顯，且逆轉倍數隨著活性單體－5 b濃度的增加而增高，與之相應的逆轉率也升高明顯，2種細胞逆轉倍數及逆轉率比較差異具有統計學意義（P ＜ 0.05），比較見表 1。

表1 活性單體-5b對2種細胞的IC50作用及耐藥逆轉比較（s）

表1 活性單體-5b對2種細胞的IC50作用及耐藥逆轉比較（s）

MCF－7 MCF－7/ADR逆轉倍數逆轉率0.14±0.02 15.74±0.08－ －0.12±0.04 14.29±0.01 1.20 9.28 0.21±0.04 11.03±0.03 1.44 30.18 0.13±0.05 7.18±0.10 2.18 54.88 0.10±0.01 2.33±0.02 6.68 85.97

4.2 FCM法檢測結果

4.2.1 細胞凋亡率 在MCF－7細胞及MCF－7/ADR細胞中加入阿霉素與活性單體－5b共同作用后，FCM法檢測發現，與MCF－7細胞的凋亡率相比，MDR的凋亡率升高的速度更快，見表2。在150 μmol/L以下濃度的的活性單體－5 b范圍內，隨著活性單體－5b濃度的增加，MDR的凋亡率升高的速度隨之加快，凋亡率增加差異比較具有統計學意義（P＜0.01）。

表2 活性單體-5b對MCF-7細胞及MCF-7/ADR細胞凋亡率影響比較（s）

表2 活性單體-5b對MCF-7細胞及MCF-7/ADR細胞凋亡率影響比較（s）

MCF－7 MCF－7/ADR 1.82±0.06 1.17±0.04 2.04±0.10 3.14±0.08 1.97±0.10 5.36±0.12 3.26±0.04 9.04±0.02 5.06±0.02 21.84±0.03

4.2.2 阿霉素含量變化情況 FCM法觀察發現，MCF－7細胞在加入不同濃度的活性單體－5 b時阿霉素熒光強度的改變差異比較無統計學意義（P ＞ 0.05）；MCF－7/ADR 細胞在加入 15.8、31.5 μmol/L兩種濃度的活性單體－5 b時，阿霉素熒光強度的改變差異無統計學意義（P ＞ 0.05），但是在加入 63.0、125 μmol/L 2 種濃度的活性單體－5 b時，阿霉素熒光強度明顯增加，差異比較有統計學意義（P ＜ 0.05）。 由此可見，在加入 63.0 μmol/L 以上，150 μmol/L 以下的活性單體－5 b的情況下，阿霉素在細胞內的蓄積含量增加，對MDR的殺傷力也隨之增強。

5 討論

人體乳腺癌的多藥耐藥（MDR）能明顯降低化療藥物的敏感性，影響化療的效果，MDR數量的增多還可能導致化療失敗，因此在乳腺癌的治療中應采取措施對MDR進行逆轉，以提高化療藥物的敏感性。中藥中有很多可以增加化療藥物敏感性的成分，如板藍根提取物5 b就是其中的一種。板藍根提取物中的活性單體5 b具有較強的免疫激活功能，并能在體外抑制癌細胞的活性。活性單體－5 b作為一種親脂化合物，其化學結構與MDR逆轉劑的化學特征較為相似，能起到良好的逆轉作用。

在研究中我們發現，在阿霉素中加入活性單體－5 b，阿霉素在細胞內的蓄積含量增加，而阿霉素對MCF－7細胞以及MCF－7/ADR細胞的抑制作用也有所增強，特別是MCF－7/ADR細胞的凋亡率明顯提升，這對乳腺癌的治療帶來新的希望。

[1]董寧寧,王明玉,張瓊.吉西他濱聯合卡培他濱治療蒽環類和紫杉類藥物耐藥的轉移性乳腺癌臨床療效分析 [J].腫瘤防治研究,2010,13(1):67－68.

[2]張鳳春,樓麗廣,唐衛東,等.托瑞米芬和他莫昔芬對MCF7/ADR多藥耐藥的逆轉作用[J].現代腫瘤醫學,2009,81(9):54－55.

[3]Toshiaki Saeki,Takashi Tsuruo,Wakao Sato,et al.Drug resistance in chemotherapy for breast cancer[J].2008.