乙肝免疫球蛋白不能阻斷乙肝病毒感染人絨毛膜癌細胞*

甘 露，肖小敏△，魏 明

(1暨南大學附屬第一醫院婦產科，廣東 廣州 510632;2西安醫學院基礎醫學部，陜西 西安 710021)

我國是乙型肝炎的流行病區。在圍生期和嬰幼兒時期感染乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)者中，分別有90%和25% ～30%將發展成慢性感染［1］，其成年后發生肝硬化甚至肝癌的幾率明顯增加，因此阻斷HBV宮內傳播已成為圍產醫學和傳染病學亟待解決的問題。目前產前阻斷HBV母嬰傳播的方法是在孕晚期應用乙肝免疫球蛋白(hepatitis B immunoglobulin，HBIG)，但臨床上對其效果尚存在爭議。胎盤是病毒宮內傳播發生的關鍵部位，胎盤屏障的第一層細胞是滋養層細胞，滋養細胞被廣泛用作病毒宮內傳播的靶細胞。來源于胎盤滋養層的絨毛癌細胞，與滋養層細胞特性功能基本相似。BeWo和JAR細胞，作為已建立的絨毛癌細胞系，目前被廣泛用作代表胎盤屏障的滋養層細胞模型［2－4］。因此本實驗使用不同濃度的 HBIG(103、102、10、1、0.1 IU/L)作用于HBV感染的人絨毛膜癌細胞系JAR細胞，探討其在體外阻斷HBV感染JAR細胞的作用。

材料和方法

1 細胞來源

以源于滋養層細胞的人絨毛膜癌細胞系JAR細胞作為滋養細胞模型，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

2 主要試劑

HBV血清為2009年收集的乙肝患者HBV陽性血清，ELISA檢測乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)、乙肝 e 抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)、乙肝核心抗體(hepatitis B core antibody，anti－HBc)均為陽性，經熒光定量PCR檢測血清HBV－DNA滴度為5×1011copies/L，無合并甲、丙、丁、戊肝的實驗室依據，使用前用無血清 RPMI－1640，1∶5 稀釋，并通過0.22 μm 孔徑濾器過濾除菌，分裝，置于－80℃保存。陰性血清為體檢正常人的外周血血清，同上處理。HBIG購自四川遠大蜀陽藥業有限公司;RPMI－1640細胞培養基和胎牛血清購自Gibco;鼠抗人HBsAg單克隆抗體(Ⅰ抗)、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)標記羊抗鼠Ⅱ抗購自北京中杉金橋生物工程公司;人類基因組DNA提取和純化試劑盒:Biospin Cell Genomic DNA Extraction Kit(離心柱型，Cat:BSC0531)購自BioFlux;乙型肝炎病毒核酸擴增熒光定量檢測試劑盒(Cat.#DA－D051)購自中山大學達安基因股份有限公司;其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

3 主要方法

3.1 MTT比色法 檢測不同濃度的HBIG(終濃度分別為 103IU/L、102IU/L、10 IU/L、1 IU/L、0.1 IU/L)對JAR細胞的作用。取適量用細胞計數板進行計數。調整細胞濃度至108/L，取100 μL接種至96孔板，每孔細胞數約為104個，每組6孔。將96孔板放回CO2培養箱繼續培養，待細胞長到板面積70%，分別加入不同濃度的HBIG，陰性對照組不加HBIG，空白對照孔不加細胞，只加培養基。置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中。培養24 h，于24 h后每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，37℃繼續孵育4 h后，吸棄孔內培養基，每孔加入 DMSO 150 μL，振蕩10 min，在酶標儀上選擇測定波長570 nm，參照波長為630 nm，測定各孔吸光度(A值)。各組A值=各組測得的A值－空白組A值均值。

3.2 細胞內DNA提取及熒光定量PCR檢測HBV－DNA HBV血清感染體外培養的JAR細胞，不同濃度的 HBIG(終濃度為 103、102、10、1、0.1 IU/L)干預，24 h后采用BioFlux公司人類基因組DNA提取和純化試劑盒提取、純化細胞內DNA，按試劑盒操作。采用中山大學達安基因股份有限公司HBV核酸擴增熒光定量檢測試劑盒進行HBV－DNA檢測，按試劑盒操作。

3.3 細胞免疫熒光染色法 制作細胞爬片，待細胞長滿片的50%，加入HBV陽性血清孵育，24 h后取出細胞爬片，PBS洗5 min共12次。室溫下，4%多聚甲醛固定20 min;用PBS洗5 min共3次;0.3%Triton X－100室溫處理5 min;PBS洗，10 min共3次;山羊封閉血清室溫封閉1 h，不洗;加入1∶50稀釋的鼠抗人HBsAg單克隆抗體(Ⅰ抗)，4℃過夜;PBS洗10 min，共3次;加入1∶100稀釋FITC標記的Ⅱ抗，37℃避光孵育1 h;PBS洗10 min，共3次;加入DAPI，室溫避光孵育5 min;PBS洗5 min，共2次;甘油封片，4℃避光保存30 min;激光共聚焦顯微鏡下觀察染色結果。

4 統計學處理

用SPSS 13.0統計軟件進行分析。數據用均數±標準差()表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較用SNK檢驗或Tamhane's T2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 MTT結果

各濃度HBIG組的A值與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，說明此次設定的各個濃度的HBIG對JAR細胞的生長無顯著影響，見表1。

表1 不同濃度HBIG對JAR細胞生長作用Table 1.The growth of JAR cells in different groups(.n=6)

表1 不同濃度HBIG對JAR細胞生長作用Table 1.The growth of JAR cells in different groups(.n=6)

HBIG 103IU/L 0.56 ±0.16 HBIG 102IU/L 0.58 ±0.16 HBIG 10 IU/L 0.54 ±0.11 HBIG 1 IU/L 0.56 ±0.12 HBIG 0.1 IU/L 0.52 ±0.11 Negative control 0.56 ±0.14

2 實時熒光定量PCR結果

以不同濃度HBIG培養的各組細胞內均檢測到HBV－DNA的存在，但各組之間的HBV－DNA拷貝數沒有顯著差異(P＞0.05)。陰性對照組和空白對照組均為陰性，見表2。

3 免疫細胞熒光染色法

通過激光共聚焦顯微鏡，在JAR細胞胞質內檢測到HBsAg免疫反應陽性物質(綠色)，呈片狀或團塊狀分布。特別的是在細胞核的邊上HBsAg免疫反應陽性物質呈點狀分布，且熒光較強，如戒指結構。在第1組到第6組各組中，無論加入HBIG終濃度的高低，均可在JAR細胞胞質內檢測到HBsAg免疫反應陽性物質，見圖1。隨機抽取10個不同視野，進行拍照。每個視野圈定10個以上的細胞。利用軟件對圈定的每個細胞進行熒光灰度分析。各實驗組與陰性對照組比較，細胞內HBsAg熒光強度差異有統計學意義(P＜0.05);各實驗組與空白對照組比較，細胞內HBsAg熒光強度差異有統計學意義(P＜0.05);各實驗組之間比較，細胞內HBsAg熒光強度差異無顯著(P ＞ 0.05)，見表3。

表2 不同組JAR細胞內HBV－DNA拷貝數Table 2.The copies of HBV－DNA in JAR cells in different groups(.n=4)

表2 不同組JAR細胞內HBV－DNA拷貝數Table 2.The copies of HBV－DNA in JAR cells in different groups(.n=4)

aThe numbers were logarithmically transformed.P ＞0.f05.

Group HBV－DNA copiesa HBV+HBIG 103IU/L 4.80 ±0.56 HBV+HBIG 102IU/L 5.00 ±0.62 HBV+HBIG 10 IU/L 5.00 ±0.54 HBV+HBIG 1 IU/L 5.10 ±0.83 HBV+HBIG 0.1 IU/L 4.89 ±0.65 HBV 5.04 ±0.70 Negative control ＜3 Blank control ＜3

討 論

目前臨床尚對孕晚期應用HBIG阻斷HBV宮內傳播的效果尚存在爭議。一部分研究者認為孕晚期使用HBIG對阻斷HBV母嬰傳播有效［5］。而一部分學者認為新生兒出生后常規主被動免疫，已經能阻斷大部分的HBV母嬰傳播，孕晚期使用HBIG性價比不高，甚至是沒有阻斷效果。張平等［6］按使用HBIG情況分組觀察使用效果，發現孕期使用HBIG對阻斷宮內感染無效。朱科倫等［7］對HBV陽性孕婦于孕28周后每月接種HBIG 200 IU，定期檢測孕婦血HBsAg、HBV－DNA和 HBsAb，發現 HBsAg和HBV－DNA無明顯降低，HBsAb無明顯升高，認為HBV陽性孕婦孕期注射的HBIG劑量尚未能完全中和孕婦血清中的HBV，HBIG中和病毒的作用和效果尚值得懷疑。

Figure 1.The localization of HBsAg was examined by laser scanning confocal microscopy(×400).HBsAg(green)was found in JAR cells in the test groups.HBsAg was located in the cytoplasm or at the edge of the nucleus(blue).a1－c1:HBV+103IU/L HBIG;a2－c2:HBV+102IU/L HBIG;a3－c3:HBV+10 IU/L HBIG;a4－c4:HBV+1 IU/L HBIG;a5－c5:HBV+0.1 IU/L HBIG;a6－c6:HBV;a7－c7:blank control(fetal bovine serum);a8－c8:negative control(healthy people serum).圖1 激光共聚焦顯微鏡檢測HBsAg的定位

表3 不同組JAR細胞內HBsAg熒光強度Table 3.The HBsAg expression in JAR cells in different groups(.n=100)

表3 不同組JAR細胞內HBsAg熒光強度Table 3.The HBsAg expression in JAR cells in different groups(.n=100)

*P ＜0.05 vs HBV group.

Group Fluorescent intensity HBV+HBIG 103IU/L 583.14 ±116.85 HBV+HBIG 102IU/L 581.90 ±69.13 HBV+HBIG 10 IU/L 582.26 ±107.46 HBV+HBIG 1 IU/L 576.24 ±118.22 HBV+HBIG 0.1 IU/L 583.79 ±118.56 HBV 615.28 ±134.59 Negative control 275.91 ±48.26*Blank control 295.43 ±44.50*

針對孕晚期使用HBIG的爭議，HBV病毒血清體外感染細胞的可能性，我們采用高病毒載量的HBV－DNA陽性血清感染體外培養的JAR細胞，模擬母胎界面，應用不同濃度的HBIG去干預，檢測細胞內的HBV－DNA拷貝數的差異。HBV－DNA陽性直接反應了病毒的復制水平，同時也提示宿主具有傳染性。目前，臨床上認為HBIG濃度至少達到10 IU/L才有保護作用［8］。因此本次實驗設定5個HBIG 的濃度，分別為 103、102、10、1、0.1 IU/L。其中前2個濃度高于最低保護濃度，后2個濃度低于最低保護濃度。同時設立陰性對照組(正常人血清)和空白對照組(胎牛血清)。

首先，采用MTT法檢測各濃度HBIG對JAR細胞生長的影響，結果利用單因素方差分析得出P＞0.05，說明本次實驗設定的各濃度的HBIG對JAR細胞生長的差異無顯著。可以進行后續實驗。在與HBV陽性血清共同孵24 h后提取JAR細胞內的DNA，采用實時熒光定量PCR檢測HBV－DNA的拷貝數，得出各組細胞內均檢測到HBV－DNA的存在，但各組之間的HBV－DNA的拷貝數沒有顯著差異。陰性對照組和空白對照組均為陰性。

實時熒光定量PCR結果提示，較高濃度的HBIG組(終濃度為103IU/L和終濃度為102IU/L)的JAR細胞內的HBV－DNA拷貝數與第6組(只加病毒)的JAR細胞內的HBV－DNA拷貝數相比無顯著差異;激光共聚焦顯微鏡結果也提示這2組細胞內HB-sAg熒光強度與第6組相比無顯著差異。這說明在體外條件下高于最低保護濃度的10倍、100倍濃度的抗體也并不能阻斷HBV感染JAR細胞。

Partovi等［9］用非房室模型計算肌注HBIG的藥代動力學參數，如果肌注HBIG的患者抗HBs滴度300 IU/L可以3周后再注射，如果滴度在200～300 IU/L之間3周內注射，滴度在151～200 IU/L之間2周注射，滴度在100～151 IU/L需1周內注射，而滴度小于100 IU/L應立即注射。對于HBsAg滴度較高者注射HBIG后，由于中和作用，抗HBs滴度將較快降低而難以維持在有效濃度。此研究提示若不管HBsAg、HBeAg和HBV－DNA濃度的差別，一律于孕晚期注射3次HBIG 200 IU可能是不合理的。

而孫玉革等［10］對慢性攜帶HBV的孕婦于孕晚期注射HBIG 200或400 IU。動態觀察結果顯示，無論在注射后24 h、72 h、1周、2周、4周，還是3次注射結束后l周，HBV－DNA水平和注射前比較均無下降趨勢，無顯著差異(均P＞0.05)。此研究說明注射小劑量HBIG后的各個時段都不會對HBVDNA水平產生影響，注射HBIG前后HBV標志物無變化，更無anti－HBs檢出。

結合我們的實驗，高于臨床最低保護濃度的抗體并不能阻斷HBV感染JAR細胞。因此，我們認為目前在臨床上孕晚期應用200 IU HBIG直接阻斷乙肝病毒感染滋養細胞的途徑值得懷疑，孕期應用HBIG是否還能通過其它途徑阻斷宮內HBV傳播則有待進一步研究。

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