肥胖大鼠海馬內TNF－α、胰島素降解酶、PPARγ和Aβ的表達及其作用

楊思思，姜 騰，張木勛

(華中科技大學附屬同濟醫院內分泌科，湖北 武漢 430030)

隨著生活水平提高和生活方式改變，肥胖已成為世界范圍的多發病，它是非傳染性疾病的重要危險因素之一［1］。阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種嚴重的中樞神經系統退行性疾病，嚴重損害患者的認知功能，造成患者自理能力障礙及精神行為異常。流行病學研究顯示，肥胖是AD的獨立危險因子［2］。AD最典型的病理改變是:淀粉樣β肽(amyloid β －peptide，Aβ)沉積導致的老年斑及微管相關蛋白tau過度磷酸化導致的神經纖維纏結，多數學者認為Aβ沉積是AD始發病理生理學改變，可導致tau蛋白過度磷酸化［3－5］。研究顯示肥胖人群海馬內Aβ沉積較正常人群出現得早且重［6］，具體機制仍不清楚，有學者認為與肥胖時機體處于慢性炎癥狀態有關。肥胖時機體呈現由炎癥因子誘導產生的全身性慢性低度炎癥狀態，研究表明TNF－α表達增加可引起Aβ沉積［7－9］。胰島素降解酶 (insulindegrading enzyme，IDE)是體內降解Aβ的重要酶之一，胰島素及Aβ均是其作用底物，兩者可競爭性與其結合。IDE表達減少可使Aβ降解減少從而沉積［5］。另外，IDE表達可能受過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator－activated receptor γ，PPARγ)調控［10］。本實驗旨在研究肥胖時 TNF －α、PPARγ及IDE表達，從而探討肥胖時海馬內 Aβ沉積增多的機制。

材料和方法

1 動物模型

雄性SD大鼠(華中科技大學同濟醫學院動物中心提供)，體重180～220 g，10～12周齡。隨機將大鼠分為對照組(control，CTL組)與肥胖組(obesity，OB組)。CTL組予正常飲食、OB組予高脂高糖高蛋白飲食(熱卡百分比為碳水化合物26.0%，蛋白質15.2%，脂肪58.8%)飼養12周。大鼠肥胖判斷標準:經高糖高脂高蛋白飼料喂養，大鼠體重超過普通飼料喂養的20%作為OB組。成模后斷頸處死所有老鼠，快速斷頭冰上操作取雙側海馬，一側分為兩半，分別放入2個滅菌離心管中(分別用于實時熒光定量PCR和Western blotting);另一側置于4%多聚甲醛中固定(用于免疫組織化學染色)。

2 觀察指標及方法

2.1 一般指標測定 (1)血糖(plasma glucose)測定:處死前由尾靜脈采血，用血糖儀(強生穩豪)檢測血糖水平。(2)血漿胰島素(plasma insulin)測定:處死前心臟取血1 mL，離心后取血漿，－20℃保存，放射免疫法一次性檢測。藥盒購自北京原子能研究所。(3)胰島素抵抗指標計算:穩態模型胰島素抵抗指數(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA－IR)=空腹胰島素(fasting plasma insulin，mIU/L)×空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG，mmol/L)/22.5［11］。

2.2 實時熒光定量PCR檢測海馬內TNF－α、淀粉樣 β 蛋白前體(amyloid β －protein precursor，APP)、PPARγ及IDE mRNA水平 用Trizol法提取各組織總RNA，測定樣品中260 nm和280 nm吸收峰的A值，鑒定RNA純度和含量。逆轉錄－聚合酶鏈反應:按照逆轉錄試劑盒操作步驟制備cDNA;20 μL體系，實時熒光定量PCR儀上樣;反應條件95℃ 3 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，重復40 個循環。由熔解曲線判定PCR反應的特異性，根據標準曲線以及熒光曲線的Ct值計算定量結果。通過2－ΔΔCt計算各指標的表達，ΔCt=Ct目的基因－ Ct內參照，ΔΔCt=ΔCt實驗組－ΔCt模型對照組，cDNA 表達差別倍數以 2－ΔΔCt表示。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

2.3 Western blotting檢測大鼠海馬 TNF － α、Aβ42、PPARγ及IDE蛋白水平 取海馬放入勻漿器內，加入蛋白質提取液，冰上勻漿(總蛋白質提取液購自武漢凌飛科技公司)。于4℃、12000×g離心10 min，取上清即為蛋白質。取10 μL用Bradford法檢測蛋白質濃度，余儲存于－80℃備用。用前加2×樣本緩沖液并混勻，于100℃變性5 min。在具10道雙垂直電泳槽孔內加入約12 μg蛋白質，10%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)，結束轉至PVDF膜。搖床上5%的脫脂奶粉中封閉，37℃ 1 h;雜交Ⅰ抗［Aβ42(Epitomics)、IDE(Epitomics)、PPAR γ (Santa Cruz)和TNF－α(Abcam)］4℃過夜。TBST洗膜3次，每次10 min;雜交Ⅱ抗(辣根酶標記的羊抗兔、羊抗鼠IgG，購自Santa Cruz)，室溫搖床上1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL試劑盒顯色(ECL試劑盒購于武漢凌飛科技公司)。運用Quantity One凝膠吸光度分析軟件對免疫反應條帶進行定量分析。

2.4 免疫組織化學法檢測大鼠海馬中TNF－α、Aβ42、PPARγ及IDE組織表達 海馬經4%多聚甲醛中固定48 h后，經梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制作冠狀石蠟切片，按照免疫組織化學染色步驟:烘片、脫蠟至水、抗原修復、血清封閉、加Ⅰ抗、加Ⅱ抗、DAB顯色、蘇木素復染、分化、封片、照相。用計算機圖像分析系統(Olympus)隨機選擇5個視野內的陽性表達區域進行圖像掃描分析，得到平均吸光度值，平均吸光度越大，表示相關的抗原表達越強。

3 統計學處理

用SPSS 11.5數據處理軟件進行統計處理。計量資料以均數±標準差()表示。各組均數間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 兩組大鼠體重、血糖、胰島素及胰島素抵抗程度的比較

表2顯示OB組及MET組血糖較CTL組無明顯差異;OB組體重上升高于20%，血漿胰島素水平及胰島素抵抗程度均高于CTL組(P＜0.01，P＜0.05)，說明高糖高脂高蛋白飲食造肥胖大鼠模型成功。

表2 動物分組及一般資料Table 2.Design of experimental rats and laboratory data(.n=10)

表2 動物分組及一般資料Table 2.Design of experimental rats and laboratory data(.n=10)

CTL:control;OB:obesity.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs CTL.

Group Diet Weight(g)Plasma glucose(mmol/L) Plasma insulin(U/L)HOMA－IR CTL Normal 300.2 ±16.8 6.72 ±0.32 7.48 ±0.46 2.85 ±0.76 OB High glucose，high fat and high protein 416.3 ±14.8* 9.54 ±2.10 19.10 ±4.86＊＊ 6.38 ±2.01*

2 實時熒光定量PCR檢測大鼠海馬內TNF－α、APP、PPARγ及IDE的mRNA表達水平

圖1顯示，OB組大鼠海馬內APP和TNF－α mRNA水平較CTL組升高，PPARγ和IDE mRNA表達下降。

Figure 1.Expression of TNF － α，APP，PPARγ and IDE mRNA in rat hippocampi analyzed by real－time fluorescence quantitative PCR.CTL:control group;OB:obesity group..n=10.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs CTL.圖1 實時熒光定量PCR檢測大鼠海馬內的APP、TNF－α、PPARγ及IDE mRNA表達水平

3 運用免疫印跡檢測兩組大鼠海馬內TNF－α、Aβ42、PPARγ和 IDE 水平

圖2顯示，與CTL組比較，OB組海馬內TNF－α及Aβ42表達明顯上調(P＜0.05)，PPARγ及 IDE表達下調(P＜0.05)。

Figure 2.Western blotting analysis of TNF － α，Aβ42，PPARγ and IDE in rat hippocampi.CTL:control group;OB:obesity group..n=10.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs CTL.圖2 免疫印跡檢測大鼠海馬內 TNF－α、Aβ42、PPARγ及IDE水平

4 運用免疫組化技術檢測2組大鼠海馬內各指標

圖3顯示OB組較CTL組海馬神經細胞內TNF－α和Aβ42表達增加，PPARγ和IDE表達減少。陽性表達鏡下觀察呈褐色改變。

Figure 3.Immunohistochemical staining of TNF－α，Aβ42，PPARγ and IDE in rat hippocampi(×400).CTL:control group;OB:obesity group..n=10.*P＜0.05 vs CTL.圖3 免疫組化技術檢測兩組大鼠海馬內TNF－α、Aβ42、PPARγ及IDE的表達

討 論

肥胖常伴有胰島素抵抗及慢性炎癥反應，研究證明后者是導致肥胖胰島素抵抗的關鍵原因［12］。肥胖時外周炎癥因子水平升高，其中TNF－α是主要的致炎因子，可影響胰島素受體和胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1，IRS1)的酪氨酸磷酸化并導致IRS1的泛素化及降解，降低蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)的活癥導致胰島素抵抗。研究顯示肥胖時海馬內Aβ沉積與胰島素抵抗相關，深入研究證實炎癥因子在兩者的關系中起到重要作用［2，13－14］。Aβ 沉積是 AD 患者最典型的病理生理改變，正常情況下Aβ的產生和降解是平衡的，當此平衡被打破就會引起Aβ異常沉積，目前認為Aβ清除減少是打破此平衡的關鍵點［14］。沉積的Aβ可使Tau蛋白磷酸化，兩者導致斑塊形成、神經原纖維纏積，最終引起 AD 的發生［3－5］。Aβ 由其前體蛋白APP經酶水解生成有病理意義的Aβ40和Aβ42，其中Aβ42易聚集，具有更強的細胞毒性［2，14］。IDE 是一種含鋅的金屬肽酶，在Aβ42降解中起到重要作用。有研究證實IDE功能缺陷可導致腦中Aβ降解障礙，而IDE過度表達可降低Aβ水平、延遲或完全預防腦中淀粉樣斑塊的形成［5］。IDE 表達受 PPARγ 調控［10］，下調PPARγ可使IDE轉錄減少，從而水平下降。研究發現外周炎癥反應，炎癥介質TNF－α刺激可以引起PPARγ下降;另外，已證實PPARγ配體具有抗炎效應［5］，激活 PPARγ可減輕炎癥反應，炎癥因子表達減少。那么，肥胖時Aβ增加，除了因胰島素水平增加競爭性抑制Aβ與IDE結合降低其降解Aβ的作用外，是否與炎癥因子下調PPARγ表達，從而降低IDE基因轉錄有關呢?

本研究我們檢測了肥胖大鼠海馬內炎癥因子TNF－α mRNA的表達，結果顯示肥胖組海馬TNF－α mRNA表達較正常組顯著上升，這與前人研究結果一致。在此基礎上，我們進一步檢測大鼠海馬內Aβ42及IDE表達，結果顯示肥胖組 Aβ42水平上調、IDE下降。IDE作為Aβ42的降解酶，兩者呈負相關。在本次實驗中，我們還觀察到肥胖時大鼠海馬內隨著TNF－α表達上調，PPARγ表達是下降的，這提示炎癥因子TNF－α可能下調PPARγ表達;另外，PCR結果顯示肥胖組IDE mRNA水平下降，表明肥胖時IDE轉錄減少，且此時PPARγ表達亦下降。由上述結果我們可推測，肥胖時腦內Aβ沉積增加的機制可能為:肥胖時機體處于慢性炎癥狀態，大腦也不例外，其中炎癥因子TNF－α表達上調;這使得神經細胞內PPARγ表達減少，IDE表達下調，Aβ42沉積增加。IDE作為降解Aβ42的關鍵酶，其表達下調可直接致使Aβ42沉積增加。

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