吡咯烷二硫代氨基甲酸酯對2型糖尿病大鼠腎臟的保護作用*

張新杰，劉建坤，高冬梅，張怡梅，朱鐵年△，趙瑞景

(1白求恩國際和平醫院腫瘤科，河北 石家莊 050082;2邯鄲市中心醫院內分泌科，河北 邯鄲 056001;3河北醫科大學免疫學教研室，河北 石家莊 050017)

目前，全球糖尿病(diabetes mellitus，DM)患病率不斷增加，其慢性并發癥是致盲、致殘、致死的主要原因。據統計超過1/3的DM患者會發生并發癥，而且超過70%DM患者死于糖尿病血管病變［1］。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病主要的微血管并發癥之一，其發病機制尚未完全闡明，近年來氧化應激在其發病中的作用越來越受到重視。本研究旨在探討抗氧化劑吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)對糖尿病腎臟的保護作用及機制。

材料和方法

1 材料

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)及PDTC均購于Sigma;兔抗誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和鼠抗硝基酪氨酸(nitrotyrosine，NT)抗體購于Santa Cruz;PV6001試劑盒、PV6002試劑盒和DAB顯色劑購于北京中杉金橋生物技術有限公司;快速血糖儀購于強生公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutases，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH－Px)測定試劑盒購于南京建成生物科技公司。清潔級雄性Wistar大鼠37只，體重180～210 g，購于河北醫科大學動物中心［許可證號(冀)2008－1－003，批號為 901010］。高脂飼料參照Reed等［2］報道的配方自行配制，其中普通飼料熱量組成比值為:碳水化合物占65.5%，脂肪占10.3%，蛋白質占24.2%。高脂飼料熱量組成比值為:碳水化合物占39%，脂肪占42%，蛋白質占18%，其中脂肪主要為熟豬油和蛋黃粉。

2 方法

2.1 2型糖尿病大鼠模型的建立 參照Reed等［2］方法建立2型糖尿病大鼠模型。所有大鼠經適應性喂養1周后，隨機分為2組:正常對照組12只，高脂飲食組25只，分別給予普通飼料和高脂飼料喂養。2組大鼠均自由飲水攝食，晝夜周期12 h，室溫控制在(24±4)℃，每周觀察大鼠體重、血糖變化。喂養8周后，高脂組按27 mg/kg體重一次性腹腔注射STZ，72 h后測血糖值，以隨機血糖≥16.7 mmol/L為2型糖尿病大鼠造模成功，共成模24只。將成模大鼠隨機分為2組，糖尿病模型組12只，PDTC治療組12只。PDTC治療組大鼠腹腔注射PDTC(50 mg·kg－1·d－1)，正常對照組、糖尿病組大鼠每天給予同體積的生理鹽水腹腔注射。治療1周后，禁食12 h，斷頭處死，留取血漿及腎臟組織進行相關指標檢測。

2.2 血糖測定 采用快速血糖儀測定。

2.3 腎皮質勻漿中MDA含量、SOD和 GSH－Px活性的測定 取組織塊，稱重，放入玻璃勻漿管中，加入預冷的生理鹽水，生理鹽水的量是組織重量的9倍，充分勻漿10 min左右，低溫離心機3000r/min離心10～15 min，留上清棄沉淀，然后嚴格按照試劑盒說明書分別測定SOD和GSH－Px的活性和MDA含量。

2.4 尿微量白蛋白/肌酐的測定 PDTC治療結束后，收集尿液，使用國產深圳邁瑞BS－120全自動生化分析儀測定尿微量白蛋白/肌酐比值。

2.5 腎臟HE和Masson染色 取腎皮質用10%中性甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋后切片，分別進行HE和Masson染色，光鏡下觀察腎臟形態學改變。

2.6 電鏡觀察大鼠腎臟組織超微結構變化 取1 mm×1 mm×1 mm大小腎皮質，經前固定、漂洗、后固定、漂洗、脫水、浸透、包埋、聚合、切片、染色等步驟，于日立H－7500透射電鏡下觀察并拍照。

2.7 免疫組化觀察大鼠腎臟組織iNOS和NT表達石蠟切片常規脫蠟至水，3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，PBS洗5 min×3次，抗原熱修復(120℃、2 min)，正常山羊血清封閉，室溫15 min，傾去血清，滴加Ⅰ抗(兔抗 iNOS 1∶100，鼠抗 NT 1∶60)，濕盒中4℃過夜，PBS洗5 min×3次，滴加山羊抗兔(或小鼠)IgG抗體 －HRP多聚體(PV6001、PV6002)，37℃孵育1 h，PBS洗5 min×3次，DAB 顯色，顯微鏡下控制反應時間，蒸餾水終止反應;蘇木素復染，脫水，透明中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，細胞質中棕黃色顆粒為陽性。數據處理:采用專業圖像分析軟件Image－Pro Plus 6.0進行處理。分別挑選高倍鏡視野下各組腎皮質內被染成棕黃色的區域作為測量區域，測得切片上陽性染色區域的吸光度值，每張切片分別隨機選取20個視野，測量吸光度，取其平均值，作為平均吸光度值，并以此代表實驗所研究腎皮質內iNOS和NT的表達強度進行分析。

3 統計學處理

數據用SPSS 13.0軟件處理，計量資料以均數±標準差()表示，數據進行正態性檢驗及方差齊性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組空腹血糖比較

糖尿病模型(DM)組大鼠空腹血糖(26.55±7.10)mmol/L，與正常對照(NC)組(5.58 ±0.43)mmol/L相比明顯增高(P＜0.01);PDTC治療(DM+PDTC)組大鼠空腹血糖(11.55 ±2.89)mmol/L，與DM組相比明顯降低(P＜0.01)。

2 各組大鼠腎皮質中SOD、GSH－Px活性和MDA含量比較

PDTC治療1周后，DM組大鼠的SOD和GSHPx活性均明顯低于 NC組(P＜0.01，P＜0.05);PDTC治療組大鼠的SOD和GSH－Px活性均明顯高于DM組，顯著差異(均P＜0.01)。DM組大鼠的MDA含量明顯高于NC組(P＜0.01);PDTC治療組MDA含量明顯低于DM組(P＜0.01)，見表1。

表1 各組大鼠腎皮質MDA含量和SOD、GSH－PX活性比較Table 1.Comparison of MDA content，SOD and GSH － Px activity in the cortex of kidney in each group(.n=6)

表1 各組大鼠腎皮質MDA含量和SOD、GSH－PX活性比較Table 1.Comparison of MDA content，SOD and GSH － Px activity in the cortex of kidney in each group(.n=6)

NC:normal control group;DM:diabetes group;DM+PDTC:PDTC－treated diabetes group;SOD:superoxide dismutase;GSH－ Px:glutathione peroxidase;MDA:malondialdehyde.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs NC group;##P ＜0.01 vs DM group.

Group SOD［103U/(g protein)］GSH－Px(unit of activity)MDA［μmol/(g protein )］NC 188.73±1.49 2437.51±259.19 0.89±0.17 DM 71.50±3.01＊＊ 1667.32 ±81.16* 5.01 ±1.01＊＊DM+PDTC 161.00±2.55## 2392.78±174.01## 1.60±0.64##

3 各組大鼠尿微量白蛋白/肌酐的比較

PDTC治療1周后，DM組大鼠的尿微量白蛋白/肌酐明顯高于NC組，顯著差異(P＜0.01)，PDTC治療組大鼠的尿微量白蛋白/肌酐明顯低于DM組，顯著差異(P＜0.01)，見表2。

表2 各組大鼠尿微量白蛋白和尿肌酐的比較Table 2.Comparison of urine microalbumin and urine creatinine in each group(.n=6)

表2 各組大鼠尿微量白蛋白和尿肌酐的比較Table 2.Comparison of urine microalbumin and urine creatinine in each group(.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs NC group;##P ＜0.01 vs DM group.

NC 180.46 ±8.99 1525.09±221.86 1.97±0.40 DM 395.8 ±14.5＊＊ 3753.30±852.28* 5.05±0.70＊＊DM+PDTC 270.2 ±30.41## 2387.10±230.78## 3.65±0.36##

4 腎臟組織HE及Masson染色(膠原纖維染色)

HE染色光鏡下觀察，正常對照組腎小球和腎小管結構正常，毛細血管清晰;糖尿病模型組腎小球肥大，腎小球系膜基質增多，可見部分腎小管上皮細胞空泡變性、萎縮、壞死;PDTC治療組較糖尿病模型組腎小管和腎小球損害減輕，見圖1A。Masson染色光鏡下觀察，糖尿病模型組腎小球肥大，膠原纖維染色綠染面積增多，纖維化明顯，球囊擴張明顯;PDTC治療組病理改變較糖尿病模型組明顯減輕，見圖1B。

Figure 1.Morphological changes of glomeruli in rat kidneys(×400).A:HE staining;B:Masson staining.圖1 大鼠腎臟組織HE和Masson染色觀察腎小球形態學變化

5 腎臟組織超微結構改變

透射電鏡觀察腎皮質超微結構。正常對照組:基底膜正常無增厚，足細胞排列整齊，足突無融合;糖尿病模型組:基底膜高度增厚，厚度不均，有斷裂層，足突融合;PDTC治療組:基底膜輕度增厚，足突有輕度融合，病理改變較糖尿病模型組明顯減輕，見圖2。

Figure 2.Ultrastrcture of rat kidney cortex observed by transmission eletron microscopy(×20000).Rats in NC group exhibited normal podocyte ultrastructure，including ordered，upright podocyte foot processes(arrows).DM rats exhibited fusion of foot processes，variation of the width of the filtration slits，the broadening of foot processes with a reduction of the number of filtraion processes perunitlength，abd podocyte damage(arrows).PDTC －treated rats exhibited almost normal podocyte ultrastructure(arrows).圖2 透射電鏡觀察大鼠腎臟皮質超微結構

6 各組大鼠腎臟組織iNOS和NT表達情況

iNOS、NT陽性反應物位于胞質中，呈棕黃色。糖尿病模型組iNOS表達水平(0.47±0.08)較正常對照組(0.23±0.02)明顯增多(P＜0.01);PDTC治療組iNOS表達水平(0.31±0.05)較糖尿病模型組明顯減低(P＜0.05)，見圖3。糖尿病模型組NT表達(0.39 ±0.04)較正常對照組(0.22 ±0.01)明顯增多(P ＜0.01);PDTC 治療組 NT表達(0.29±0.03)較糖尿病模型組明顯減低(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.Immunohistochemical staining of iNOS and NT in rat kidneys(×400).圖3 免疫組化檢測大鼠腎臟組織中iNOS和NT表達

討 論

DN作為糖尿病的慢性并發癥，其發病率隨著糖尿病的快速增長而逐年上升，已成為終末期腎病的主要原因。在歐洲發達國家20%～40%的糖尿病患者最終發展為 DN，成為透析治療患者的首要原因［3］，其治療花費巨大。糖尿病腎病的一個早期指標是尿白蛋白排泄增加，尿微量白蛋白/肌酐是診斷早期糖尿病腎病的一項敏感指標。在本研究中DM組大鼠尿微量白蛋白/肌酐比值明顯增高，經PDTC治療后尿微量白蛋白/肌酐明顯減低。DN的主要病理改變是腎小球病變，早期表現為基底膜增厚和系膜基質增多，晚期則表現為硬化性改變，不伴明顯細胞增生。目前對其發病機制尚不清楚。最近大量研究發現氧化應激與DN的發生發展密切相關［4］。具有里程碑意義的糖尿病控制和并發癥試驗(Diabetes Control and Complications Trial，DCCT)和其后續的糖尿病干預和并發癥流行病學(Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications，EDIC)研究也發現氧化應激和硝化應激在糖尿病并發癥的發生發展中起重要作用［5］。

機體進行有氧代謝時，不斷地通過非酶促反應和酶促反應產生活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，并被胞內、胞外的抗氧化系統有效清除。糖尿病高血糖狀態下，以腎組織中糖代謝紊亂為主的多種因素綜合造成腎組織中化學性質活潑的ROS產生過多，破壞腎組織正常的清除能力，過多不穩定的ROS將與脂質、蛋白、DNA等分子相互作用導致腎組織學改變和功能異常，造成氧化應激。因此測定體內氧化和抗氧化酶的水平可間接反應腎臟的損傷程度。SOD是超氧陰離子自由基的清除劑，可抑制自由基引起的脂質過氧化反應。GSH－Px是機體內廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶，它特異地催化還原型谷胱甘肽等對過氧化氫的還原反應，可以起到保護細胞膜結構和功能完整的作用。機體通過酶系統與非酶系統產生氧自由基，后者能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化作用，并因此形成脂質過氧化物，如MDA、酮基、羥基或新的氧自由基等。MDA是過氧化脂質降解產物，其含量常可反映機體內脂質過氧化的程度。因而測定MDA的量可反映機體內脂質過氧化程度，間接反映細胞損傷程度［4］。本實驗結果顯示:DM組大鼠腎皮質中SOD和GSH－PX活性均較NC組明顯降低，而MDA含量較NC組明顯升高;經PDTC治療后，SOD和GSH－PX活性明顯增加，而MDA含量明顯降低。表明在糖尿病大鼠腎臟組織中，氧化與抗氧化系統失衡，抗氧化酶的活性下降，引起系膜細胞損傷。PDTC治療后，抗氧化酶活性升高，脂質過氧化程度降低，證明PDTC可通過抗氧化來減輕氧化應激對腎臟的損傷。

氧化應激狀態下可激活一系列信號通路如NF－ κB［6－7］。NF － κB 被活化后上調其下游 iNOS 基因的表達，使NO生成明顯增多。NO是一種信息傳遞分子，容易彌散，半衰期很短，在組織中直接測定非常困難。Kolodziejska等［8］的研究表明，直接檢測組織中iNOS可客觀反映組織中NO的含量。過量的NO可與超氧陰離子迅速結合生成氧化作用更強的過氧亞硝基陰離子(ONOOˉ)，過量產生的ONOOˉ可通過多種機制修飾多種生物分子，導致血管內皮細胞、平滑肌細胞等結構破壞、功能喪失，最終導致糖尿病多種并發癥的發生。糖尿病腎病患者腎活檢組織和糖尿病動物腎臟組織中ONOOˉ的形成和氧化應激增加［9］。而NT是ONOOˉ在體內生成的特異性標志物，通過檢測NT的生成可反映ONOOˉ的產生［10］。

我們課題組和他人的研究已證實，PDTC可降低糖尿病大鼠的血糖水平［11－12］。本研究經 HE及Masson染色發現，糖尿病模型組腎小球肥大，基底膜增厚，系膜間質增多。電鏡顯示糖尿病模型組基底膜明顯增厚，足細胞腫脹，足突融合。免疫組化染色顯示糖尿病模型組iNOS和NT表達明顯增多，進一步證實糖尿病腎病早期損害與iNOS和NT表達增多有關。經PDTC治療后腎臟病理改變明顯減輕，iNOS和NT表達明顯減少。本實驗結果提示，PDTC一方面可通過降低血糖控制高糖毒性，另一方面，因PDTC是NF－κB阻斷劑，其可能通過阻斷NF－κB信號通路，減少iNOS和NT表達，降低氧化應激和硝化應激對腎臟的損害，從而達到對糖尿病腎臟的保護作用。本研究結果為PDTC防治糖尿病腎病提供了實驗依據。

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