Zfp521在大鼠骨髓間充質干細胞向神經元分化過程中的表達變化及意義*

韓 瑞，周 燕，王舒陽，張廣宇，彭 越，王翠琴，魯晶晶，彭 濤，賈延劼△

(鄭州大學第一附屬醫院1神經內科，2放射科，河南 鄭州 450052)

骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有多向分化潛能的多能成體干細胞，可以向神經細胞分化［1－2］。誘導MSCs分化為神經細胞，有可能在神經系統疾病的治療和修復中提供新的可行性方法，但MSCs的分化機制及影響因素等問題研究尚不清楚［3－4］。Kamiya 等［5］研究發現，鋅指蛋白521(zinc finger protein 521，Zfp521)是胚胎干細胞神經分化的關鍵因子之一，其作為早期的神經核蛋白，在胚胎干細胞分化為神經細胞中發揮重要的激活和促進作用。Zfp521能否在骨髓間質干細胞中表達，及Zfp521是否在MSCs的神經分化過程中發揮作用尚未有報道。本研究通過體外誘導大鼠MSCs分化為神經細胞，觀察Zfp521在MSCs的表達情況及誘導前、后Zfp521的表達變化，探討Zfp521在MSCs神經分化中的作用及意義。

材料和方法

1 動物

SPF級Wistar大鼠，鼠齡8～12周，雌雄不限，體質量150～200 g，由河南省實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(豫)2005－0001。常規從大鼠股骨中分離提取MSCs［6］，連續傳代10代以上的細胞置于液氮中凍存備用。

2 主要試劑

DMEM液體培養基、胎牛血清購自Gibco;神經元特異性烯醇化酶(neuron－specific enolase，NSE，sc－15343)、微管相關蛋白2(microtubule－associated protein 2，MAP－2，sc－20172)、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP，sc － 9065)、Zfp521(sc－84808)兔抗多克隆抗體均購自 Santa Cruz;Cy3標記山羊抗兔IgG(H+L)購自上海碧云天公司;AEC顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司;大鼠Rn－Zfp521－siRNA(SI01690976)、陰性對照 siRNA、轉染試劑 HiPerFect、RNeasy Mini試劑盒、QIAGEN? OneStep RT－PCR試劑盒均為Qiagen產品;凝聚胺、多聚賴氨酸購自Sigma;其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。所用引物由上海生工基因技術有限公司根據設計合成，見表1。

3 主要方法

3.1 細胞培養及實驗分組 取培養第10代以上的MSCs復蘇，按照2×106cells/well的比例接種于24孔細胞培養板，置于37℃、5%CO2培養箱內培養，待細胞融合率為50% ～70%時進行轉染，根據轉染不同，選擇同時點同一培養板MSCs隨機分為3組:未轉染組、轉染組(轉染Rn－Zfp521－siRNA)和陰性對照組(轉染negative control siRNA)。

表1 引物序列Table 1.Primer sequence

3.2 大鼠MSCs轉染 按照Qiagen公司的操作說明書，細胞融合度達50% ～70%時，每孔加入1.1 mL完全培養基(DMEM培養基+10%胎牛血清+青、鏈霉素)，放置于37℃、5%CO2培養箱內孵育。同時，分別取300 ng siRNA(Rn－Zfp521－siRNA、negative control siRNA)，溶于 100 μL DMEM 培養基中，再加入HiPerFect轉染試劑6 μL，混勻，室溫孵育10 min后，將轉染復合物均勻滴入含MSCs的孔內，使siRNA終濃度達到20 nmol/L，放置于37℃、5%CO2培養箱內孵育。未轉染組MSCs不進行轉染，其它培養條件同各轉染組。轉染后在倒置熒光顯微鏡下觀察Alexa Fluor 488標記的轉染組、Cy3標記的陰性對照組MSCs熒光表達情況，評價細胞轉染效率。RT－PCR法進一步檢測轉染后各組MSCs中Zfp521表達變化。

3.3 體外誘導MSCs分化為神經細胞 參照我們的方法［7］，待培養孔板內細胞融合率達50% ～70%，取誘導組進行誘導。去除DMEM完全培養基，DHanks液清洗3次，加入預誘導液(DMEM培養基+10%胎牛血清+1 mmol/L β－巰基乙醇)置于37℃、5%CO2條件下培養24 h。預誘導后，去除預誘導液，加入誘導液(DMEM培養基，10 mmol/L β－巰基乙醇)，37℃、5%CO2條件下培養5 h。

3.4 免疫細胞化學染色法 將各組細胞用PBS清洗之后，迅速經4%多聚甲醛、4℃固定過夜，0.2%Triton X－100處理10 min，并用封閉液封閉1 h。然后分別用 NSE 抗體(1.0 mg/L)、MAP－2抗體(1.0 mg/L)、GFAP 抗體(1.0 mg/L)及 Zfp521 抗體(1.0 mg/L)4℃孵育24 h。用PBS洗3遍后，用Cy3標記山羊抗兔IgG(1∶200)或AEC顯色試劑盒在室溫下進行染色標記、觀察。細胞圖像通過顯微鏡用×20攝取。每組獨立的實驗都會采集超過30個區域的細胞。而且，在明視野下所采集的每幅圖像都盡量包含相同的細胞數目。采用雙人雙盲隨機記數陽性細胞，計算陽性細胞百分比例。

3.5 Western blotting 分別收集各組細胞，PBS液漂洗1遍，按照1×106加入100 μL雙去污裂解液(10 mmol/L pH 6.8 Tris － H Cl，1%SDS，1%TritonX－100，100 mg/L PMSF，100 mg/L 抑肽酶)的比例充分裂解細胞，4℃ 12000 r/min離心10min，保留上清，－80℃貯存備用，以BCA法測定總蛋白濃度。SDS－PAGE采用5%濃縮膠、8%分離膠，上樣量為100 μg，電壓90V恒壓18 min跑到濃縮分離交界處，更改電壓為120V，繼續電泳55min。電泳結束后取出凝膠轉移至同等大小的硝酸纖維素膜上。轉移后的硝酸纖維素膜置于封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST溶液)4℃過夜，加入兔抗Zfp521多克隆抗體(1∶200)，室溫處理2 h，TBST 漂洗10 min×3 次;辣根過氧化物酶聯抗兔IgG(1∶5000)室溫處理2 h，PBST漂洗10 min×3次;ECL顯色液中反應至條帶清晰。

3.6 RT－PCR 采用RNeasy Mini試劑盒分離純化各組細胞的總RNA，分光光度法測定并計算提取的總RNA含量及濃度。參照Qiagen? OneStep RT－PCR試劑盒實驗操作說明進行RT－PCR，總反應體積 50.0 μL，其中 5 × Qiagen OneStep RT － PCR Buffer 10.0 μL，dNTP Mix 2.0 μL，Qiagen OneStep RT－ PCR Enzyme Mix 2.0 μL，5 × Q － Solution 10.0 μL，RNase inhibitor 10 U，RNA 1.0 μg，引物 0.6 μmol/L。擴增條件為:50℃逆轉錄30min，95℃ 15 min，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，30～35個循環，72℃ 10 min。GAPDH擴增條件:94℃預變性1 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 10 min。然后，取 RT －PCR 產物10.0 μL，加上樣緩沖液 2.0 μL，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，70 V 40 min，凝膠圖像成像系統拍攝保存實驗結果，凝膠圖像分析系統(GelPro Analyzer 3.0)分析，計算待測基因與內參照GAPDH平均灰度值的比值，比較各組間待測基因/GAPDH比值的大小。

4 統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件進行分析。數據用均數±標準差()表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 大鼠MSCs轉染

轉染后各組細胞形態變化不顯著，僅見少數細胞脫落、胞體收縮呈球形或梭形。轉染組和陰性對照組轉染72 h后熒光表達最強，陰性對照組評價轉染效率為83.5% ±2.6%，轉染組轉染效率為84.1%±2.3%，見圖1。RT－PCR結果顯示轉染組Zfp521表達較未轉染組及對照組減少(P＜0.05)，見圖2。

Figure 1.Alexa Fluor 488－labeled transfected group and Cy3－labeled negative control group(72 h after transfection，×200).A，B:transfection group;C，D:negative control group.A，C:inverted microscope;B，D:fluorescent microscope.圖1 Alexa Fluor 488標記的轉染組和Cy3標記的陰性對照siRNA轉染

Figure 2.The expression of Zfp521 mRNA 72 h after transfection.1:non － transfection group;2:transfection group;3:negative control group.*P ＜ 0.05 vs other groups.圖2 轉染72 h后Zfp521 mRNA的表達

2 β－巰基乙醇體外誘導MSCs分化為神經細胞

2.1 細胞形態學變化 誘導2 h后各組MSCs開始出現少數細胞胞體收縮呈圓形、錐形，細胞突起細長，誘導5h后，多數細胞胞體收縮呈圓形、錐形，細胞突起細長，交織成網，形成較典型的神經細胞結構。少量細胞脫落、死亡。轉染組細胞誘導后細胞形態變化更加明顯，未轉染組和對照組類似。

2.2 誘導后神經細胞鑒定 免疫組織化學結果顯示，轉染組 NSE、MAP－2的陽性細胞比率分別為83.6% ±1.4%，85.4% ±1.2%，顯著高于未轉染組和對照組(P＜0.05)，但各組GFAP表達率均小于1%，見圖3、表 2。Western blotting結果顯示 NSE、MAP－2蛋白表達高于其它2組(P＜0.05)，見圖4。RT－PCR顯示轉染組 NSE mRNA、MAP－2 mRNA表達顯著高于其它2組(P＜0.05)，見圖5。

3 Zfp521在MSCs中表達及神經分化中的變化

免疫組織化學結果顯示，Zfp521在各組MSCs均有表達，誘導5 h后各組Zfp521表達均明顯下降，差異顯著(P＜0.01)，見圖6、表3。Western blotting結果顯示，蛋白大小為148 kD處可見Zfp521蛋白表達，誘導5 h后Zfp521表達量顯著下降(P＜0.01)，見圖7。RT－PCR顯示誘導5 h后MSCs Zfp521 mRNA表達顯著低于MSCs(P＜0.01)，見圖8。

Figure 3.The expression of NSE and MAP －2 in β －mercaptoethanol－induced differentiation of MSCs into neurons 5 h after induction(×200).A，B，C:the expression of NSE;D，E，F:the expression of MAP －2;A，D:non－transfection group;B，E:transfection group;C，F:negative control group.圖3 β－巰基乙醇誘導各組MSCs分化為神經細胞后NSE和MAP－2的表達

表2 β－巰基乙醇誘導5 h各組NSE和MAP－2的表達Table 2.The expression of NSE and MAP－25 h after induction by β－mercaptoethanol(%..n=10)

表2 β－巰基乙醇誘導5 h各組NSE和MAP－2的表達Table 2.The expression of NSE and MAP－25 h after induction by β－mercaptoethanol(%..n=10)

*P ＜0.05 vs other groups.

Group NSE MAP－2 GFAP Non－transfection 75.7 ±1.0 78.4 ±1.8 ＜1 Transfection 83.6 ±1.4* 85.4 ±1.2* ＜1 Negative control 74.3 ±0.9 77.1 ±1.5 ＜1

Figure 4.The expression of NSE and MAP－2 proteins 5 h after induction.1:non － transfection group;2:transfection group;3:negative control group.*P ＜ 0.05 vs other groups.圖4 NSE和MAP－2蛋白的表達

Figure 5.The expression of NSE and MAP－2 mRNA 5 h after induction..n=10.1:non－transfection group;2:transfection group;3:negative control group.*P＜0.05 vs other groups.圖5 NSE和MAP－2 mRNA的表達

討 論

Figure 6.The expression of Zfp521 before and after induction(×200).A，B，C:before induction;D，E，F:after induction;A，D:non － transfection group;B，E:transfection group;C，F:negative control group.圖6 誘導前后Zfp521的表達

表3 各組細胞誘導前后Zfp521的表達Table 3.The expression of zfp521 in each group before and after induction(%..n=10)

表3 各組細胞誘導前后Zfp521的表達Table 3.The expression of zfp521 in each group before and after induction(%..n=10)

＊＊P ＜0.01 vs before induction.

Group Before induction After induction Non － transfection 88.9 ±2.0 38.4 ±1.5＊＊Transfection 75.2 ±1.4 29.3 ±1.8＊＊Negative control 85.6 ±1.9 38.6 ±1.3＊＊

Zfp521屬于C2H2型家族鋅指蛋白，由1311個氨基酸序列組成，其內穿插著30個Krüppel樣鋅指結構域，在氨基酸末端，一種13－A元件連接到核重塑和組蛋白去乙酰化復合物(nucleosome remodelling and histone deacetylase，NuRD)中并在幾個轉錄共抑制物中相對保守［8－10］。Zfp521廣泛存在于肌肉、心臟、脾、胰、腎、淋巴結、胸腺及胎兒肝組織，在腦組織內Zfp521含量也十分豐富，尤其在小腦［11－13］。它在鼠的類同源物，Evi/Zfp521，在造血祖細胞、神經干細胞、小腦顆粒層原始神經細胞及發育中的紋狀體中含量均為豐富［9］，Zfp521在發育中及成熟神經干細胞中高表達提示在中樞神經系統的個體發育及特殊功能調節方面發揮了重要作用［14］。但 Zfp521在MSCs中是否表達尚未有報道，本研究通過對兩組細胞中Zfp521表達量進行檢測，發現大鼠MSCs可表達 Zfp521，且表達率可達 88.9% ±2.0%，提示Zfp521在骨髓間質干細胞的發育和維持上發揮了重要作用。

Figure 7.The expression of Zfp521 protein before and after induction..n=10.1:non－transfection group;2:transfection group;3:negative control group.*P ＜0.05 vs before induction.圖7 誘導前后Zfp521蛋白的表達

Figure 8.The expression of Zfp521 mRNA before and after induction..n=10.1:non－transfection group;2:transfection group;3:negative control group.*P ＜0.05 vs before induction.圖8 誘導前后Zfp521 mRNA的表達

進一步研究發現，Zfp521作為轉錄因子，不僅可以特異性結合DNA和RNA，還能與DNA－RNA雜交雙鏈分子以及其它鋅指蛋白或自身結合，與基因表達調控、細胞分化、胚胎發育、干細胞調節及腫瘤形成有密切關系［8］。Kamiya 等［5］研究發現，在胚胎干細胞中，Zfp521作為早期的神經核蛋白，具有有效的神經分化激活作用，尤其在促進外胚層祖細胞向神經外胚層轉化中發揮重要激活作用，通過建立的過表達Zfp521模型中，發現Sox1、Sox3及Pax6基因表達增加，而Oct6或Fgf5基因表達未有增加，提示Zfp521在促進干細胞神經分化中是通過激活早期神經外胚層基因，而不是抑制非神經相關基因的表達。研究發現［5］，在神經分化抑制因子骨形態發生蛋白4(bone morphogenetic proteins 4，BMP4)存在狀態下，強制表達Zfp521也可使胚胎干細胞進行神經分化。Zfp521可與其共激活物 p300(p300 coactivator)結合，激活早期神經相關基因，處于外胚層狀態的胚胎干細胞分化為神經外胚層祖細胞，進而分化為神經祖細胞，也可通過減少神經相關抑制因子促進神經分化。研究發現，在一些未成熟細胞的分化過程中Zfp521的表達量逐漸下降［15］。但在骨髓間質干細胞的神經分化過程中Zfp521的表達變化尚未有報道。本研究通過檢測MSCs誘導分化前后兩組細胞Zfp521的表達量，免疫組織化學法檢測誘導前MSCs中Zfp521表達率為88.9% ±2.0%，分化為神經細胞后Zfp521的表達明顯下降，表達率為38.4% ±1.5%，抑制Zfp521表達可提高MSCs的神經分化效率，RT－PCR及Western blotting法檢測顯示有同樣的結果，提示Zfp521在MSCs的神經分化過程中可能發揮了重要調控作用。其可能的作用機制為:一方面，Zfp521可能通過其N－端13－AA基序連接到NuRD復合物，募集NuRD蛋白，并與其它轉錄因子反應，作用于靶基因，在轉錄和翻譯水平上調控基因的表達［13］。另一方面，Zfp521是骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)信號轉導通路中的一個分子，BMP通路在細胞分化、發育過程中發揮重要作用［8，16］，在 BMP2 和 BMP4 途徑中，Zfp521 與轉錄因子SMAD－1、SMAD－4結合形成復合物，進入細胞核作用于靶基因，對干細胞增殖及分化發揮重要的調控作用［16］。抑制Zfp521可能減弱了BMP的抑制作用，從而促進神經分化。

綜上所述，通過本研究發現，骨髓間質干細胞中Zfp521表達量較高，誘導MSCs分化為神經細胞后，Zfp521表達量明顯下降，抑制Zfp521可促進神經細胞的分化，提示Zfp521在MSCs誘導分化為神經細胞過程中可能發揮重要調控作用。但Zfp521在MSCs神經分化過程中具體作用機制尚不明確，有待于進一步研究。

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