Zfp521在大鼠骨髓間充質干細胞向神經元分化過程中的表達變化及意義*

韓 瑞，周 燕，王舒陽，張廣宇，彭 越，王翠琴，魯晶晶，彭 濤，賈延劼△

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院1神經內科，2放射科，河南 鄭州 450052)

骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有多向分化潛能的多能成體干細胞，可以向神經細胞分化［1－2］。誘導MSCs分化為神經細胞，有可能在神經系統疾病的治療和修復中提供新的可行性方法，但MSCs的分化機制及影響因素等問題研究尚不清楚［3－4］。Kamiya 等［5］研究發(fā)現，鋅指蛋白521(zinc finger protein 521，Zfp521)是胚胎干細胞神經分化的關鍵因子之一，其作為早期的神經核蛋白，在胚胎干細胞分化為神經細胞中發(fā)揮重要的激活和促進作用。Zfp521能否在骨髓間質干細胞中表達，及Zfp521是否在MSCs的神經分化過程中發(fā)揮作用尚未有報道。本研究通過體外誘導大鼠MSCs分化為神經細胞，觀察Zfp521在MSCs的表達情況及誘導前、后Zfp521的表達變化，探討Zfp521在MSCs神經分化中的作用及意義。

材料和方法

1 動物

SPF級Wistar大鼠，鼠齡8～12周，雌雄不限，體質量150～200 g，由河南省實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(豫)2005－0001。常規(guī)從大鼠股骨中分離提取MSCs［6］，連續(xù)傳代10代以上的細胞置于液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

2 主要試劑

DMEM液體培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco;神經元特異性烯醇化酶(neuron－specific enolase，NSE，sc－15343)、微管相關蛋白2(microtubule－associated protein 2，MAP－2，sc－20172)、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP，sc － 9065)、Zfp521(sc－84808)兔抗多克隆抗體均購自 Santa Cruz;Cy3標記山羊抗兔IgG(H+L)購自上海碧云天公司;AEC顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司;大鼠Rn－Zfp521－siRNA(SI01690976)、陰性對照 siRNA、轉染試劑 HiPerFect、RNeasy Mini試劑盒、QIAGEN? OneStep RT－PCR試劑盒均為Qiagen產品;凝聚胺、多聚賴氨酸購自Sigma;其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。所用引物由上海生工基因技術有限公司根據設計合成，見表1。

3 主要方法

3.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組 取培養(yǎng)第10代以上的MSCs復蘇，按照2×106cells/well的比例接種于24孔細胞培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待細胞融合率為50% ～70%時進行轉染，根據轉染不同，選擇同時點同一培養(yǎng)板MSCs隨機分為3組:未轉染組、轉染組(轉染Rn－Zfp521－siRNA)和陰性對照組(轉染negative control siRNA)。

表1 引物序列Table 1.Primer sequence

3.2 大鼠MSCs轉染 按照Qiagen公司的操作說明書，細胞融合度達50% ～70%時，每孔加入1.1 mL完全培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+青、鏈霉素)，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內孵育。同時，分別取300 ng siRNA(Rn－Zfp521－siRNA、negative control siRNA)，溶于 100 μL DMEM 培養(yǎng)基中，再加入HiPerFect轉染試劑6 μL，混勻，室溫孵育10 min后，將轉染復合物均勻滴入含MSCs的孔內，使siRNA終濃度達到20 nmol/L，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內孵育。未轉染組MSCs不進行轉染，其它培養(yǎng)條件同各轉染組。轉染后在倒置熒光顯微鏡下觀察Alexa Fluor 488標記的轉染組、Cy3標記的陰性對照組MSCs熒光表達情況，評價細胞轉染效率。RT－PCR法進一步檢測轉染后各組MSCs中Zfp521表達變化。

3.3 體外誘導MSCs分化為神經細胞 參照我們的方法［7］，待培養(yǎng)孔板內細胞融合率達50% ～70%，取誘導組進行誘導。去除DMEM完全培養(yǎng)基，DHanks液清洗3次，加入預誘導液(DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1 mmol/L β－巰基乙醇)置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。預誘導后，去除預誘導液，加入誘導液(DMEM培養(yǎng)基，10 mmol/L β－巰基乙醇)，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)5 h。

3.4 免疫細胞化學染色法 將各組細胞用PBS清洗之后，迅速經4%多聚甲醛、4℃固定過夜，0.2%Triton X－100處理10 min，并用封閉液封閉1 h。然后分別用 NSE 抗體(1.0 mg/L)、MAP－2抗體(1.0 mg/L)、GFAP 抗體(1.0 mg/L)及 Zfp521 抗體(1.0 mg/L)4℃孵育24 h。用PBS洗3遍后，用Cy3標記山羊抗兔IgG(1∶200)或AEC顯色試劑盒在室溫下進行染色標記、觀察。細胞圖像通過顯微鏡用×20攝取。每組獨立的實驗都會采集超過30個區(qū)域的細胞。而且，在明視野下所采集的每幅圖像都盡量包含相同的細胞數目。采用雙人雙盲隨機記數陽性細胞，計算陽性細胞百分比例。

3.5 Western blotting 分別收集各組細胞，PBS液漂洗1遍，按照1×106加入100 μL雙去污裂解液(10 mmol/L pH 6.8 Tris － H Cl，1%SDS，1%TritonX－100，100 mg/L PMSF，100 mg/L 抑肽酶)的比例充分裂解細胞，4℃ 12000 r/min離心10min，保留上清，－80℃貯存?zhèn)溆茫訠CA法測定總蛋白濃度。SDS－PAGE采用5%濃縮膠、8%分離膠，上樣量為100 μg，電壓90V恒壓18 min跑到濃縮分離交界處，更改電壓為120V，繼續(xù)電泳55min。電泳結束后取出凝膠轉移至同等大小的硝酸纖維素膜上。轉移后的硝酸纖維素膜置于封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST溶液)4℃過夜，加入兔抗Zfp521多克隆抗體(1∶200)，室溫處理2 h，TBST 漂洗10 min×3 次;辣根過氧化物酶聯抗兔IgG(1∶5000)室溫處理2 h，PBST漂洗10 min×3次;ECL顯色液中反應至條帶清晰。

3.6 RT－PCR 采用RNeasy Mini試劑盒分離純化各組細胞的總RNA，分光光度法測定并計算提取的總RNA含量及濃度。參照Qiagen? OneStep RT－PCR試劑盒實驗操作說明進行RT－PCR，總反應體積 50.0 μL，其中 5 × Qiagen OneStep RT － PCR Buffer 10.0 μL，dNTP Mix 2.0 μL，Qiagen OneStep RT－ PCR Enzyme Mix 2.0 μL，5 × Q － Solution 10.0 μL，RNase inhibitor 10 U，RNA 1.0 μg，引物 0.6 μmol/L。擴增條件為:50℃逆轉錄30min，95℃ 15 min，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，30～35個循環(huán)，72℃ 10 min。GAPDH擴增條件:94℃預變性1 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 10 min。然后，取 RT －PCR 產物10.0 μL，加上樣緩沖液 2.0 μL，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，70 V 40 min，凝膠圖像成像系統拍攝保存實驗結果，凝膠圖像分析系統(GelPro Analyzer 3.0)分析，計算待測基因與內參照GAPDH平均灰度值的比值，比較各組間待測基因/GAPDH比值的大小。

4 統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件進行分析。數據用均數±標準差()表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 大鼠MSCs轉染

轉染后各組細胞形態(tài)變化不顯著，僅見少數細胞脫落、胞體收縮呈球形或梭形。轉染組和陰性對照組轉染72 h后熒光表達最強，陰性對照組評價轉染效率為83.5% ±2.6%，轉染組轉染效率為84.1%±2.3%，見圖1。RT－PCR結果顯示轉染組Zfp521表達較未轉染組及對照組減少(P＜0.05)，見圖2。

Figure 1.Alexa Fluor 488－labeled transfected group and Cy3－labeled negative control group(72 h after transfection，×200).A，B:transfection group;C，D:negative control group.A，C:inverted microscope;B，D:fluorescent microscope.圖1 Alexa Fluor 488標記的轉染組和Cy3標記的陰性對照siRNA轉染

Figure 2.The expression of Zfp521 mRNA 72 h after transfection.1:non － transfection group;2:transfection group;3:negative control group.*P ＜ 0.05 vs other groups.圖2 轉染72 h后Zfp521 mRNA的表達

2 β－巰基乙醇體外誘導MSCs分化為神經細胞

2.1 細胞形態(tài)學變化 誘導2 h后各組MSCs開始出現少數細胞胞體收縮呈圓形、錐形，細胞突起細長，誘導5h后，多數細胞胞體收縮呈圓形、錐形，細胞突起細長，交織成網，形成較典型的神經細胞結構。少量細胞脫落、死亡。轉染組細胞誘導后細胞形態(tài)變化更加明顯，未轉染組和對照組類似。

2.2 誘導后神經細胞鑒定 免疫組織化學結果顯示，轉染組 NSE、MAP－2的陽性細胞比率分別為83.6% ±1.4%，85.4% ±1.2%，顯著高于未轉染組和對照組(P＜0.05)，但各組GFAP表達率均小于1%，見圖3、表 2。Western blotting結果顯示 NSE、MAP－2蛋白表達高于其它2組(P＜0.05)，見圖4。RT－PCR顯示轉染組 NSE mRNA、MAP－2 mRNA表達顯著高于其它2組(P＜0.05)，見圖5。

3 Zfp521在MSCs中表達及神經分化中的變化

免疫組織化學結果顯示，Zfp521在各組MSCs均有表達，誘導5 h后各組Zfp521表達均明顯下降，差異顯著(P＜0.01)，見圖6、表3。Western blotting結果顯示，蛋白大小為148 kD處可見Zfp521蛋白表達，誘導5 h后Zfp521表達量顯著下降(P＜0.01)，見圖7。RT－PCR顯示誘導5 h后MSCs Zfp521 mRNA表達顯著低于MSCs(P＜0.01)，見圖8。

Figure 3.The expression of NSE and MAP －2 in β －mercaptoethanol－induced differentiation of MSCs into neurons 5 h after induction(×200).A，B，C:the expression of NSE;D，E，F:the expression of MAP －2;A，D:non－transfection group;B，E:transfection group;C，F:negative control group.圖3 β－巰基乙醇誘導各組MSCs分化為神經細胞后NSE和MAP－2的表達

表2 β－巰基乙醇誘導5 h各組NSE和MAP－2的表達Table 2.The expression of NSE and MAP－25 h after induction by β－mercaptoethanol(%..n=10)

表2 β－巰基乙醇誘導5 h各組NSE和MAP－2的表達Table 2.The expression of NSE and MAP－25 h after induction by β－mercaptoethanol(%..n=10)

*P ＜0.05 vs other groups.

Group NSE MAP－2 GFAP Non－transfection 75.7 ±1.0 78.4 ±1.8 ＜1 Transfection 83.6 ±1.4* 85.4 ±1.2* ＜1 Negative control 74.3 ±0.9 77.1 ±1.5 ＜1

Figure 4.The expression of NSE and MAP－2 proteins 5 h after induction.1:non － transfection group;2:transfection group;3:negative control group.*P ＜ 0.05 vs other groups.圖4 NSE和MAP－2蛋白的表達

Figure 5.The expression of NSE and MAP－2 mRNA 5 h after induction..n=10.1:non－transfection group;2:transfection group;3:negative control group.*P＜0.05 vs other groups.圖5 NSE和MAP－2 mRNA的表達

討 論

Figure 6.The expression of Zfp521 before and after induction(×200).A，B，C:before induction;D，E，F:after induction;A，D:non － transfection group;B，E:transfection group;C，F:negative control group.圖6 誘導前后Zfp521的表達

表3 各組細胞誘導前后Zfp521的表達Table 3.The expression of zfp521 in each group before and after induction(%..n=10)

表3 各組細胞誘導前后Zfp521的表達Table 3.The expression of zfp521 in each group before and after induction(%..n=10)

＊＊P ＜0.01 vs before induction.

Group Before induction After induction Non － transfection 88.9 ±2.0 38.4 ±1.5＊＊Transfection 75.2 ±1.4 29.3 ±1.8＊＊Negative control 85.6 ±1.9 38.6 ±1.3＊＊

Zfp521屬于C2H2型家族鋅指蛋白，由1311個氨基酸序列組成，其內穿插著30個Krüppel樣鋅指結構域，在氨基酸末端，一種13－A元件連接到核重塑和組蛋白去乙酰化復合物(nucleosome remodelling and histone deacetylase，NuRD)中并在幾個轉錄共抑制物中相對保守［8－10］。Zfp521廣泛存在于肌肉、心臟、脾、胰、腎、淋巴結、胸腺及胎兒肝組織，在腦組織內Zfp521含量也十分豐富，尤其在小腦［11－13］。它在鼠的類同源物，Evi/Zfp521，在造血祖細胞、神經干細胞、小腦顆粒層原始神經細胞及發(fā)育中的紋狀體中含量均為豐富［9］，Zfp521在發(fā)育中及成熟神經干細胞中高表達提示在中樞神經系統的個體發(fā)育及特殊功能調節(jié)方面發(fā)揮了重要作用［14］。但 Zfp521在MSCs中是否表達尚未有報道，本研究通過對兩組細胞中Zfp521表達量進行檢測，發(fā)現大鼠MSCs可表達 Zfp521，且表達率可達 88.9% ±2.0%，提示Zfp521在骨髓間質干細胞的發(fā)育和維持上發(fā)揮了重要作用。

Figure 7.The expression of Zfp521 protein before and after induction..n=10.1:non－transfection group;2:transfection group;3:negative control group.*P ＜0.05 vs before induction.圖7 誘導前后Zfp521蛋白的表達

Figure 8.The expression of Zfp521 mRNA before and after induction..n=10.1:non－transfection group;2:transfection group;3:negative control group.*P ＜0.05 vs before induction.圖8 誘導前后Zfp521 mRNA的表達

進一步研究發(fā)現，Zfp521作為轉錄因子，不僅可以特異性結合DNA和RNA，還能與DNA－RNA雜交雙鏈分子以及其它鋅指蛋白或自身結合，與基因表達調控、細胞分化、胚胎發(fā)育、干細胞調節(jié)及腫瘤形成有密切關系［8］。Kamiya 等［5］研究發(fā)現，在胚胎干細胞中，Zfp521作為早期的神經核蛋白，具有有效的神經分化激活作用，尤其在促進外胚層祖細胞向神經外胚層轉化中發(fā)揮重要激活作用，通過建立的過表達Zfp521模型中，發(fā)現Sox1、Sox3及Pax6基因表達增加，而Oct6或Fgf5基因表達未有增加，提示Zfp521在促進干細胞神經分化中是通過激活早期神經外胚層基因，而不是抑制非神經相關基因的表達。研究發(fā)現［5］，在神經分化抑制因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic proteins 4，BMP4)存在狀態(tài)下，強制表達Zfp521也可使胚胎干細胞進行神經分化。Zfp521可與其共激活物 p300(p300 coactivator)結合，激活早期神經相關基因，處于外胚層狀態(tài)的胚胎干細胞分化為神經外胚層祖細胞，進而分化為神經祖細胞，也可通過減少神經相關抑制因子促進神經分化。研究發(fā)現，在一些未成熟細胞的分化過程中Zfp521的表達量逐漸下降［15］。但在骨髓間質干細胞的神經分化過程中Zfp521的表達變化尚未有報道。本研究通過檢測MSCs誘導分化前后兩組細胞Zfp521的表達量，免疫組織化學法檢測誘導前MSCs中Zfp521表達率為88.9% ±2.0%，分化為神經細胞后Zfp521的表達明顯下降，表達率為38.4% ±1.5%，抑制Zfp521表達可提高MSCs的神經分化效率，RT－PCR及Western blotting法檢測顯示有同樣的結果，提示Zfp521在MSCs的神經分化過程中可能發(fā)揮了重要調控作用。其可能的作用機制為:一方面，Zfp521可能通過其N－端13－AA基序連接到NuRD復合物，募集NuRD蛋白，并與其它轉錄因子反應，作用于靶基因，在轉錄和翻譯水平上調控基因的表達［13］。另一方面，Zfp521是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)信號轉導通路中的一個分子，BMP通路在細胞分化、發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用［8，16］，在 BMP2 和 BMP4 途徑中，Zfp521 與轉錄因子SMAD－1、SMAD－4結合形成復合物，進入細胞核作用于靶基因，對干細胞增殖及分化發(fā)揮重要的調控作用［16］。抑制Zfp521可能減弱了BMP的抑制作用，從而促進神經分化。

綜上所述，通過本研究發(fā)現，骨髓間質干細胞中Zfp521表達量較高，誘導MSCs分化為神經細胞后，Zfp521表達量明顯下降，抑制Zfp521可促進神經細胞的分化，提示Zfp521在MSCs誘導分化為神經細胞過程中可能發(fā)揮重要調控作用。但Zfp521在MSCs神經分化過程中具體作用機制尚不明確，有待于進一步研究。

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