孕酮對氧糖剝奪損傷的PC12細胞的保護作用*

侯志慧， 王國紅， 吳春平， 李東亮

(新鄉醫學院生理學與神經生物學教研室，河南新鄉453003)

血液中的葡萄糖通過血腦屏障進入腦組織需要相應的運載工具，即葡萄糖轉運蛋白(glucose trans-port proteins，GLUT)來完成［1］。腦組織表達 GLUT1和GLUT3，GLUT1主要在微血管內皮上表達，而神經元則主要表達GLUT3。正常情況下，腦細胞主要依賴葡萄糖的有氧氧化獲得能量。缺氧缺血時，葡萄糖的有氧氧化受到抑制，腦細胞轉為依靠葡萄糖的無氧糖酵解來獲取能量。然而，無氧糖酵解產生ATP的效率下降，要滿足腦細胞對能量的需求，就需要大量葡萄糖作為底物，葡萄糖進入腦細胞必須借助細胞膜上的GLUT3進行跨膜轉運。因此GLUT3表達的多少就成為決定缺血時腦細胞對葡萄糖利用效率的首要因素，在腦缺氧缺血損傷的病理過程中起關鍵作用，是干預腦缺氧缺血損傷的重要靶點。探索缺氧缺血時增強神經元葡萄糖供給和攝取能力的調控因素具有重要意義。本實驗室前期在缺氧缺血新生鼠和缺血－再灌注大鼠已經證實孕酮(progesterone，PROG)對缺血腦組織有保護作用［1－2］，還觀察到孕酮可上調缺氧缺血新生鼠腦組織GLUT1和GLUT3的表達［3］。為排除體內復雜內環境的影響，本研究采用神經生長因子(nerve growth factor，NGF)誘導分化的具有典型神經元結構和功能特性的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞，建立其氧糖剝奪(oxygen－glucose deprivation，OGD)損傷模型，模擬體內腦缺氧缺血條件，進一步在體外研究孕酮抗神經元缺氧缺血損傷的保護作用并探討其對GLUT3的干預作用。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 2－(2－甲氧基－4－硝苯基)－3－(4－硝苯基)－5－(2，4－二磺基苯)－2H－四唑單鈉鹽［2－(2－methoxy－4－nitrophenyl)－3－(4－nitrophenyl)－5－(2，4－disulfophenyl)－2H－tetrazolium sodium salt，WST－8］細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒和乳酸鹽脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒均購自碧云天生物技術研究所;羊抗鼠GLUT3多克隆抗體購自Santa Cruz;逆轉錄試劑盒A3500購自Promega;Trizol試劑和NGF 2.5S購自Invitrogen;胎牛血清購自杭州四季青公司;DMEM培養基、DMEM培養基(無糖，無酚紅)和孕酮均購自Sigma。

1.2 細胞系 PC12細胞購于中國科學院上海生科院細胞資源中心。

2 方法

2.1 細胞培養及實驗分組 PC12細胞采用DMEM培養基，內含10%胎牛血清、1×105U/L氨芐青霉素和1×105U/L鏈霉素，置于37℃、5%CO2培養箱內常規培養，取對數生長期細胞進行實驗。實驗分為正常對照組(常規培養，不行 OGD處理)、OGD組(無糖培養基、氧濃度＜1%環境中進行OGD處理30 min后，恢復常氧常糖培養24 h)和PROG+OGD組(在OGD和復氧復糖期間培養基中含10 nmol/L孕酮，余同OGD組)。培養基中均不含酚紅，以避免對檢測結果的干擾。

2.2 PC12細胞的誘導分化 取對數生長期的PC12細胞，棄培養液，用PBS漂洗1次，加入預熱至37℃的0.25%胰酶1.5 mL，消化30 s，觀察細胞間有裂紋時，吸去胰酶，終止消化，加入預熱的含50 μg/L NGF 2.5S的 DMEM培養基，調整細胞密度至1×109cells/L，傳代培養5 d，待PC12細胞長出較長突起，具有典型神經元特征時，取誘導分化良好的PC12細胞，按實驗需要密度接種于培養板中，再誘導分化48 h，選取貼壁好，誘導分化一致的培養孔隨機按上述分組。

2.3 OGD模型的建立 參照文獻建立PC12細胞的OGD模型。取對數生長期PC12細胞，棄孔內培養液，用預熱無糖DMEM培養基漂洗2次，隨后換上預熱的無糖DMEM培養基和10 nmol/L孕酮無糖工作液，移去培養板蓋后將培養板放入(37.0±0.5)℃缺氧艙內，持續充入體積分數分別為95%N2+5%CO2的混合氣體行缺氧處理。缺氧氣體由艙底進入，艙頂排出，以10 L/min的流量置換艙內氧氣，6min后(測定艙內O2濃度降至1%以下)再以1 L/min的流量進行OGD處理30 min。OGD結束后取出培養板，OGD組更換為預熱的常糖DMEM培養基，PROG+OGD組更換為預熱的含10 nmol/L孕酮的常糖工作液，轉移到37℃、5%CO2培養箱內常氧培養24 h。

2.4 形態學觀察 將培養板置于倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞形態變化，各組均取板孔正中視野進行觀察并拍照。

2.5 WST－8比色法檢測細胞活力［4］將對數生長期的PC12細胞以5×107cells/L的密度接種于96孔板中培養，待細胞基本融合后，吸棄培養液，隨機進行分組。氧糖剝奪30 min并復氧復糖24 h后，每孔加入10 μL WST－8溶液。細胞培養箱內繼續孵育1 h后，酶標儀測定450 nm波長處吸光度值(A)，630 nm參考波長進行雙波長測定。每組設4個復孔，實驗重復3次。

2.6 LDH活性測定［5］收集各組細胞培養上清液，按LDH檢測試劑盒說明書進行操作，1 cm光程比色杯中加入工作液1 mL，細胞培養上清液200 μL，混合均勻，37℃保溫30 s，讀取初始吸光度，同時開始精確計時，1、2、3 min時分別讀取吸光度，確定每分鐘平均吸光度變化(ΔA/min)。LDH(U/L)=(ΔA樣品/min－ΔA空白/min)×F。F= 反應總體積 ×1 000/樣品體積×消光系數。

2.7 RT－PCR檢測GLUT1和 GLUT3 mRNA水平 收集各組細胞，采用RT－PCR法檢測GLUT1和GLUT3 mRNA表達，采用Trizol試劑盒(Invitrogen)提取樣品中總RNA，操作按照試劑盒說明進行，A260/A280測定RNA純度，取2 μg逆轉錄成cDNA，反應樣品分裝保存于－20℃。以 cDNA為模板，進行GLUT1、GLUT3和β－actin(內參照)擴增。PCR反應體系如下:10×PCR 緩沖液5 μL，MgCl2(25 mmol)3 μL，dNTPs(10 mmol)1 μL，上游引物(50 pmol)1 μL，下游引物(50 pmol)1 μL，模板 DNA 1 μg，DNA聚合酶(5×106U/L)0.5 μL，滅菌雙蒸水補至 50 μL。反應條件為:94℃ 2 min進行循環;94℃ 1 min，50℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環 30次(β－actin循環25次)，再72℃ 5 min。使用PCR擴增儀(Biometra)進行擴增。PCR擴增產物 10 μL與 DNA marker DL2000一起在含溴化乙啶2.0%瓊脂糖凝膠上電泳分離。電泳條帶用NIH圖像軟件ImageJ進行灰度分析，以目的基因條帶/β－actin帶的灰度值表示該目的基因mRNA相對含量。所用引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列詳見表1。

表1 引物序列Table 1.Primer sequences

2.8 Western blotting檢測GLUT3蛋白表達 收集PC12細胞后，加入細胞裂解液，冰上裂解20 min，超聲1 s，間隔5 s，連續5次，離心取上清，用BCA法測定蛋白質濃度。各組取變性蛋白15 μg進行SDSPAGE電泳分離蛋白質后，轉至PVDF膜上，經漂洗、封閉后加入小鼠β－actin單克隆抗體(稀釋度為1∶5 000)和山羊GLUT3多克隆抗體(稀釋度為1∶200)，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次15 min，加辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次15 min，ECL顯影并掃描，以 Band Scan 5.0凝膠圖像處理軟件進行各條帶灰度分析。以β－actin為內參照，各組GLUT3與β－actin條帶灰度比值表示該GLUT3相對含量。

3 統計學處理

結 果

1 PROG對氧糖剝奪PC12細胞形態的影響

正常對照組PC12細胞呈梭型，兩極伸出較長突起，有的突起可發出分枝，呈典型神經元結構特征，見圖1A;OGD組PC12細胞的密度降低，突起減少或消失，大部分細胞腫脹變圓，細胞有聚團現象，部分細胞裂解成碎片，見圖1B;PROG+OGD組細胞胞體腫脹程度較OGD組明顯減輕，大部分細胞仍呈梭形，有細而短的突起伸出，聚團現象不明顯，細胞碎片的形成減少，見圖1C。

2 PROG對氧糖剝奪PC12細胞活力的影響

WST－8比色法檢測細胞活力，A值與活細胞數成正比。OGD組A值降低，與正常對照組比較有顯著差異(P＜0.01)，而PROG+OGD組A值增高，顯著高于OGD組(P＜0.01)，提示孕酮可增加氧糖剝奪的PC12細胞的存活率，見表2。

Figure 1.Effect of PROG on morphology of PC12 cells injured by OGD(×400).A:normal control group;B:OGD group(the morphology changed obviously after OGD for 30 min and restoration for 24 h);C:PROG+OGD group(the morphology was much better than that of OGD group).圖1 PROG對氧糖剝奪損傷PC12細胞形態的影響

3 PROG對氧糖剝奪PC12細胞培養上清液中LDH活性的影響

LDH漏出量是衡量細胞損傷的重要指標，與細胞損傷程度成正比。LDH活性檢測結果顯示，OGD組培養上清液中LDH活性明顯高于正常對照組(P＜0.01)，PROG+OGD組 LDH活性明顯低于OGD組(P＜0.01)，見表2。這提示PROG可減輕OGD對PC12細胞的損傷。

表2 PROG對氧糖剝奪損傷PC12細胞活力和LDH活性的影響Table 2.Effects of progesterone on the cell viability and LDH activity of PC12 cells injured by OGD(±s.n=12)

表2 PROG對氧糖剝奪損傷PC12細胞活力和LDH活性的影響Table 2.Effects of progesterone on the cell viability and LDH activity of PC12 cells injured by OGD(±s.n=12)

＊＊P ＜0.01 vs normal group;▲▲P ＜0.01 vs OGD group.

Group Absorbance(A) LDH(U/L)Normal 0.986 ±0.060 687.5 ±82.7 OGD 0.600 ±0.050＊＊ 2 364.6 ±78.6＊＊PROG+OGD 0.766 ±0.031▲▲ 1 552.2 ±234.7▲▲

4 PROG對氧糖剝奪PC12細胞GLUT3 mRNA表達的影響

RT－PCR結果顯示，GLUT1 mRNA在正常對照組、OGD組與PROG+OGD組均未檢測到。正常對照組GLUT3 mRNA有基礎表達;OGD組GLUT3 mRNA表達上調，顯著高于正常對照組(P＜0.01);PROG+OGD組GLUT3 mRNA表達量明顯高于OGD組(P＜0.05)，見圖2。

5 PROG對氧糖剝奪PC12細胞GLUT3蛋白表達的影響

Western blotting檢測結果顯示，正常對照組PC12細胞GLUT3有少量基礎表達;OGD組PC12細胞GLUT3表達上調，明顯高于正常對照組(P＜0.01);而PROG+OGD組 GLUT3表達又明顯高于OGD組(P＜0.01)，見圖3。

討 論

孕酮被稱為神經活性甾體。近年來研究表明孕酮有減少腦梗死面積［6］、提高認知能力和促進大腦功能恢復等作用。孕酮可通過抗興奮性氨基酸(excitativeamionacids，EAA)的神經毒性作用、減輕Ca2+超載導致的神經元損傷、抗氧自由基作用、抗神經元凋亡作用等多種途徑而起到神經保護作用［7］。為排除體內復雜內環境的影響，進一步在體外印證孕酮抗缺氧缺血損傷的神經保護作用并進一步探討其機制，本研究建立PC12細胞的體外氧糖剝奪模型，模擬體內缺氧缺血條件，觀察孕酮對OGD損傷的PC12細胞形態、損傷程度、細胞活力及GLUT3表達的影響，結果顯示:孕酮可以減輕OGD所致的PC12細胞腫脹，減少LDH漏出，從而減輕細胞損傷，并且提高細胞活力。這些結果提示在體外孕酮對OGD損傷的PC12細胞具有保護作用。這與前人及我們前期體內動物研究所得到的孕酮對缺氧缺血損傷具有保護作用的結果相一致［1－3，8］。

Figure 2.Effects of PROG on the expression of GLUT1(A)and GLUT3(B)mRNA in PC12 cells injured by OGD.1:normal group;2:OGD group;3:PROG+OGD group;M:marker.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs normal group;▲P ＜0.05 vs OGD group.圖2 PROG對氧糖剝奪PC12細胞GLUT1和GLUT3 mRNA表達的影響

Figure 3.Effect of PROG on the expression of GLUT3 protein in PC12 cells injured by OGD.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs normal group;▲▲P ＜0.01 vs OGD group.圖3 PROG對氧糖剝奪PC12細胞GLUT3蛋白表達的影響

血液中的葡萄糖通過血腦屏障進入腦組織需要借助葡萄糖轉運蛋白這一運載工具來完成。GLUT3是神經元上的主要葡萄糖轉運蛋白，負責將葡萄糖轉運入神經元內［9－10］。在人腦中神經元的 GLUT3表達量明顯高于膠質細胞和內皮細胞，本實驗在PC12細胞沒有檢測到GLUT1 mRNA的表達，成為PC12細胞具有神經元屬性的又一佐證。GLUT3對葡萄糖親合力高，其轉運效率比其它轉運蛋白要高，這有利于神經元對葡萄糖的攝取，反映了腦細胞代謝旺盛的特點［11－12］。實驗室前期研究工作已經表明，孕酮上調新生鼠腦缺氧缺血海馬組織GLUT1、GLUT3 mRNA 及蛋白的表達［3，8］。而本實驗結果顯示，正常對照組PC12細胞表達少量GLUT3 mRNA和蛋白，而OGD后GLUT3 mRNA和蛋白的表達增高，PROG干預后GLUT3 mRNA和蛋白表達較OGD組又顯著增加，這一結果與本室前期在體動物研究結果相吻合。該結果提示，上調GLUT3表達是神經元對抗OGD損傷的內源性保護機制之一，而孕酮可通過增強GLUT3表達進一步啟動和促進該保護機制的進行從而發揮其抗OGD損傷的保護作用。

缺氧缺血時GLUT3上調可能與低氧情況下增加低氧誘導因子1(hypoxia－inducible factor 1，HIF－1)的表達有關。HIF－1是一種隨著細胞內氧濃度變化而調節其靶基因表達的轉錄激活因子，是由α和β亞基組成的一種異二聚體。有報道在局灶性腦缺血中，梗死周圍慢性缺血區域的HIF－1α表達增高［13］。HIF－1α除了介導缺氧應答外，對腦缺血后的神經損傷有保護作用，在腦缺血損傷和保護機制中起重要作用。Baranova等［14］研究結果顯示，當機體遭受缺血缺氧損傷時HIF－1α表達增加，通過介導缺氧應答反應，增加其靶基因的轉錄，對機體有一定的保護作用。受HIF－1直接作用的靶基因有60多個，包括促紅細胞生成素、血管內皮生長因子、cyclin G2、NIP3、葡萄糖轉運蛋白、乳酸脫氫酶、醛縮酶A、烯醇化酶、轉錄蛋白、誘導型一氧化氮合酶、內皮素－1等等［15］。這些靶基因產物或能增加缺氧組織的氧供應，或能降低細胞耗氧量，或增加葡萄糖的轉運等等，以維持內環境的穩定，使機體對缺氧產生耐受與適應。本研究發現GLUT3 mRNA表達在PROG組中顯著增高，GLUT3蛋白水平的表達與mRNA相一致，PROG+OGD組GLUT3 mRNA、GLUT3蛋白表達不僅明顯高于正常對照組，也高于OGD組。這些結果提示，孕酮可能通過上調HIF －1α靶基因GLUT3的表達提高缺氧缺血時神經元對葡萄糖的轉運效率，增強神經元對缺氧缺血的耐受，產生神經保護作用。本研究為孕酮用于臨床治療腦卒中奠定了理論基礎。

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