辛伐他汀對去卵巢大鼠骨痂骨保護素表達的影響*

王建衛， 李 杭， 潘志軍

(浙江大學醫學院附屬第二醫院骨科，浙江杭州310009)

近期的許多研究表明他汀類藥物具有促成骨作用［1－3］。我們的前期研究也證實了降脂藥－辛伐他汀(simvastatin，SVS)局部注射能促進去勢大鼠骨折愈合的質量［4］，但他汀類藥物對骨代謝的確切機制目前尚缺乏深入的研究。

骨保護蛋白(osteoprotegerin，OPG)作為一種最近發現的可溶性腫瘤壞死因子受體超家族成員，被認為對骨代謝起著重要作用。OPG是一種由成骨/基質細胞、血管內皮細胞等分泌的蛋白多糖，其通過與破骨細胞分化因子(osteoprotegerin ligand/receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，OPGL/RANKL)競爭性結合，阻止OPGL/RANKL與破骨細胞及其前體細胞膜上的受體RANK(receptor activator of nuclear factor kappa B)相結合，從而阻斷OPGL/RANKL對破骨細胞各階段產生的作用，達到抑制骨吸收的作用［5］。已有研究表明白細胞介素(interleukin，IL)、腫瘤壞死因子 β(tumor necrosis factor β，TNF－β)、1，25 二羥基維生素 D3［1，25(OH)－D3］、骨形態發生蛋白 2(bone morphogenetic protein 2，BMP－2)、轉化生長因子 β(transforming growth factor β，TGF－β)、雌激素等均能刺激成骨細胞OPG mRNA及其蛋白的表達［6－7］。雖然已有少量研究表明他汀類藥物也可影響體外培養人成骨細胞或人體血液中的OPG表達水平［8－10］，但目前尚缺乏體內組織學水平的研究結果。我們在前期研究的基礎上，對骨折標本進一步研究，以了解去勢及辛伐他汀對新生骨痂OPG表達情況的影響，為他汀類成骨作用的機制研究提供更多的證據。

材料和方法

1 動物

2月齡雌性SD大鼠(清潔級，購自浙江大學實驗動物中心)，初始體重178～201 g，飼養于清潔級動物房，23℃恒溫，晝夜12 h。大鼠飼料含鈣0.46%，含磷0.38%，自由進食自來水。

2 去勢

大鼠隨機分成OVX組(n=60)和假手術(sham)組(n=30)。按以往方法對大鼠行去勢術［11］。術后喂養于原環境。為了減少OVX后大鼠體重的增加，對OVX組大鼠實行飲食控制(即給予和sham組大鼠等量的食物)。

術后12周，各取10只大鼠，全麻后測量右側脛骨骨礦物含量(bone mineral density，BMD)。本實驗使用雙能X線吸收儀(dual－energy X－ray absorptiometer，DEXA，LUNAR Radiation)，應用其配套的小動物模式進行BMD的測量，測量電壓為76 kV，電流為150 μA。該儀器的準確率為0.3%，組間變異系數(CV)為1.3%。

3 骨折內固定模型

所有大鼠分成sham+vehicle組(n=30)、OVX+vehicle組(n=30)和OVX+SVS組(n=30)，進一步用以建立骨折內固定模型。全麻后，在右脛骨近1/3處用骨刀平整切斷脛骨，盡量不折斷同側腓骨，為穩定骨折端，用直徑0.5 mm的消毒牙科鋼絲(上海醫用縫針廠)經脛骨結節插入，對骨折端行髓內固定，縫合切口，術后抗炎3 d(青霉素8×105U，im，每天2次)。

4 給藥

骨折端皮下注射SVS或空白溶劑(vehicle)，骨折手術當天注射1次，骨折后連續5 d，每天2次。按文獻方法配制5%SVS溶液［1］，即SVS溶解于含2%二甲亞砜和0.1%小牛血清白蛋白的PBS溶液中。每次注射5 mg·kg－1的SVS或相應體積(約30～50 μL)的vehicle溶劑。本實驗的注射方法參照文獻方法進行［1］。為了避免局部反復注射對骨折愈合的干擾，本實驗中的局部注射是指鄰近骨折端的皮下注射，而不是向骨痂內的直接注射。注射針頭直徑為0.4 mm，注射器最大刻度為250 μL，最小刻度為10 μL(上海醫用激光儀器有限公司)。注射過程中避免對骨痂的干擾。

5 組織學分析

骨折后1、2、4周每組各取5只用作組織學分析。處死大鼠后連同骨痂周圍骨膜取下右側脛骨。抽出髓內釘，切取包含骨痂的骨段，4%多聚甲醛(pH 7.4)室溫下固定24 h，EDTA 液(0.5 mol/L，pH 7.4)脫鈣3～5周，每5～7 d更換新鮮脫鈣液至能被細針輕松插入。PBS液沖洗，乙醇梯度脫水，石蠟包埋。縱向5μm切片，固定于經0.01% 多聚賴氨酸表面處理的載玻片上，60℃烘干過夜。

脫鈣組織切片予增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)(武漢博士德生物工程有限公司)和OPG抗體(sc－8468)(Santa Cruz Biotechnology)免疫組化染色，每周取5個標本，每個標本1張切片，每張切片4個高倍(×400)視野。計算每個視野下所有細胞中PCNA陽性細胞占有率(分成36個單元格計數)，計算4個視野的平均值比較。對OPG免疫組化結果進行半定量分析。每張切片按染色強度記分為:弱:1;中:2;強:3。按染色范圍記分為:1:＜25%;2:25%～50%;3:＞50%。上述評分相加所得值分級為:+:2.0 ～3.0;++:3.0 ～4.5;+++:4.5 ～6.0。

6 統計學處理

本實驗為成組設計。用SPSS 11.5統計軟件進行統計學分析。BMD及PCNA陽性率數據以均數±標準差(±s)表示，行方差分析。對于OPG染色情況行多組完全隨機設計資料的Mann－Whitney秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

OVX后12周，sham組和OVX組脛骨BMD有顯著差異［分別為(0.241 ±0.010)g/cm2和(0.219 ±0.005)g/cm2，P＜0.01］。

骨折后OVX+vehicle組和OVX+SVS組分別有4只和3只大鼠死亡。無1例發生骨折端感染。3組大鼠間體重沒有顯著差異。

PCNA免疫組化陽性細胞呈棕黃色，定位在細胞核中，陰性細胞呈藍色。結果顯示OVX+vehicle組骨折后1、2、4周PCNA陽性率較sham+vehicle組分別下降17.3%、32.1%和26.1%(P＜0.01);OVX+SVS組骨折后1、2、4周 PCNA 陽性率較 OVX+vehicle組分別增加60.1%、67.7%和67.7%(P ＜0.01)，見圖1、表1。該結果提示去勢可影響骨折愈合過程中骨痂的細胞增殖，而SVS可促進骨痂細胞增殖，與我們前期的生物力學及形態學研究結果相一致［3］。

Figure 1.PCNA immunohistochemical staining of bone callus(×400).圖1 骨折后各周骨痂PCNA免疫組化染色

表1 骨痂PCNA免疫組化染色陽性率比較Table 1.Comparison of PCNA positive staining(%.±s.n=5)

表1 骨痂PCNA免疫組化染色陽性率比較Table 1.Comparison of PCNA positive staining(%.±s.n=5)

△△P＜0.01 vs sham+vehicle group;##P＜0.01 vs OVX+vehicle group.

Group 1 week 2 weeks 4 weeks Sham+vehicle 48.51 ±4.12 53.45 ±5.68 22.80 ±2.16 OVX+vehicle 40.10 ±1.64△△ 41.10 ±1.43△△ 16.84 ±2.14△△OVX+SVS 64.21 ±4.89## 68.93 ±0.64## 28.24 ±1.67##

OPG陽性染色呈棕黃色，主要表達在成骨細胞和軟骨細胞中，在骨基質中也有彌漫性黃染。半定量結果顯示OVX+vehicle組OPG表達水平最低，sham+vehicle組最高，而OVX+SVS組的OPG表達水平介于2組之間，見圖2、表2。OVX+SVS組與OVX+vehicle組間在骨折后各周均有極顯著差異(P＜0.01)，OVX+vehicle組與sham+vehicle組間在骨折后1、2周也有顯著差異(P＜0.05)。該結果表明去勢可明顯減少新生骨OPG的表達，而SVS可部分阻止因去勢引起的OPG分泌減少。

討 論

本研究從動物體內組織學水平研究了去勢及辛伐他汀局部應用對大鼠骨痂OPG表達的影響。

辛伐他汀口服后，絕大部分沉積在肝臟，僅5%分布在血液中［12］，在骨骼中的濃度則更低，如此低的濃度極易受到很多因素的干擾從而造成臨床結果的變異。同時，在正常骨骼中，由于骨重建單位相對較少，他汀類藥物的骨骼作用受到一定的限制，而在骨折愈合過程中，骨重建單位大大增加，因此，骨骼對藥物反應的表現將被放大。在本實驗中，辛伐他汀通過局部微量注射器被注射于骨折端皮下。這樣可通過局部簡單擴散作用增加骨折端的藥物濃度，該濃度將遠比通過整體給藥所能達到的骨折端濃度高。

PCNA是一個分子量為37 kD的蛋白，特異地表達于細胞增殖周期的S期。在腫瘤病理學檢查中常用于判斷腫瘤的良惡性。在骨折愈合過程中，PCNA的表達強度可以反映骨痂中的細胞增殖情況。本實驗發現去勢組骨痂PCNA表達較空白對照組低，而實驗組較去勢組高，差異均有顯著性。該結果從另一角度證明了去勢可影響大鼠骨折愈合的質量，而辛伐他汀局部注射可促進去勢大鼠的骨折愈合。

骨量的維持依賴于骨形成過程與骨吸收過程之間的動態平衡，任何影響骨代謝的因素均通過調節這一動態平衡而發揮作用。抗骨質疏松藥根據其作用機制可分為促成骨類藥物和抗骨吸收藥物，目前治療骨質疏松的大多數藥物，如雌激素、雙膦酸鹽類化合物、降鈣素、選擇性雌激素受體調節劑等，主要通過抑制骨吸收防止骨量丟失，而刺激新骨形成的藥物為數很少。他汀類藥物自最初被Mundy等［1］發現具有促成骨作用以來，隨后的很多研究均表明他汀類藥物可直接刺激成骨細胞BMP－2的表達［13－14］，從而直接促進成骨細胞的成骨作用。因而他汀類藥物被認為是一種具有直接促成骨作用的潛在抗骨質疏松藥物。

Figure 2.OPG immunohistochemical staining of bone callus(×400).圖2 骨折后各周骨痂OPG免疫組化染色

表2 骨痂OPG免疫組化陽性染色半定量分析Table 2.Semiquantitative analysis of OPG

OPG是成骨細胞分泌的一種新的TNF受體超家族成員，是成骨細胞調節破骨細胞分化及其活性的重要物質。OPG對可競爭性結合RANKL，從而抑制RANKL與破骨細胞及其細胞上RANK相結合，最終起到抑制破骨細胞增殖和分化。本實驗發現，去勢可使大鼠骨痂OPG表達減少，該結果從反面提示了雌激素通過OPG發揮抑制破骨細胞的作用機制，與以往的實驗相一致［6］。同時，本實驗還發現辛伐他汀可使去勢大鼠骨痂OPG表達增加，提示他汀類藥物不僅能刺激成骨細胞表達BMP－2，直接促進成骨細胞增殖分化，同時還通過刺激成骨細胞表達OPG間接抑制破骨細胞的增殖分化。

當然，本實驗尚存在一些不足之處。首先，我們未能對破骨細胞的數量和功能作直接或間接的檢測;其次，我們也未能對成骨細胞表達的其它因子，如BMP－2、RANKL等予以檢測。盡管如此，結合目前已有的對于OPG骨調節作用的認識，本研究提示他汀類藥物還具有間接抑制破骨細胞的作用。

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