干擾素誘導蛋白p204表達變化對大鼠血管平滑肌細胞增殖及p21表達的影響*

龍向淑， 吳 強， 宋 方

(貴州省人民醫院心血管內科，貴州貴陽550002)

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是維持血管張力和功能的主要細胞成分，在動脈粥樣硬化、高血壓以及冠狀動脈介入治療術后再狹窄等血管增殖性疾病的發生、發展過程中扮演著非常重要的角色。干擾素誘導蛋白p204(interferon－inducible protein 204，p204)是干擾素(interferon，IFN)誘導蛋白p200家族的鼠類蛋白成員，其編碼基因Ifi204由耶魯大學Lengyel教授等首先發現并成功克隆［1］，在鼠的心肌、骨骼肌、腎及成骨細胞等多種組織、細胞存在豐富表達［2］。有研究［3－5］顯示，p204可通過多種機制抑制多種細胞型的增殖，但p204在VSMCs是否存在基礎表達及其對大鼠VSMCs增殖等生物學行為的影響尚未見報道。本研究旨在通過誘導p204在VSMCs的過表達和沉默，觀察VSMCs的增殖變化，探討p204對VSMCs增殖的影響及其可能機制，為血管增殖性疾病的防治提供理論依據。

材料和方法

1 大鼠VSMCs的培養和實驗分組

IFN－α購自北京三元基因工程有限公司;DMEM高糖型細胞培養液、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自HyClone;α－SMA單克隆抗體(BM0002)、即用型SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒為武漢博士德公司產品;Control siRNA－A(sc－36869)購自 Santa Cruz;Ifi204 siRNA由寶生物工程(大連)有限公司合成，序列見表1;LipofectamineTM2000 Reagent購自Invitrogen。純種SD大鼠(雌雄不拘)3只(購自第三軍醫大學實驗動物中心)，體重120～140 g，按文獻［6］介紹的方法進行胸主動脈平滑肌細胞的培養、純化及鑒定。取4～6代細胞用于實驗。實驗分為5組，即陰性對照組(N組)、非特異性siRNA對照組(C組)、IFN－α誘導組(IFN組)、20%FBS+IFN－α組(F+I組)和Ifi204 siRNA轉染組(siRNA組)。各組干預6 h，繼續培養48 h收集細胞。

表1 siRNA及引物序列Table 1.The sequences of primers and siRNA

2 RT－PCR法檢測mRNA表達

TRNzol總RNA提取試劑(DP405)、2×Taq PCR Master Mix(KT201)、100 bp DNA ladder購自北京天根公司;RT－PCR兩步法試劑盒購自 TaKaRa(DRR047A);PCR擴增引物由寶生物工程(大連)有限公司合成(表1)。按TRNzol總RNA提取試劑盒說明操作提取總RNA，取1 μg按RT－PCR試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA，取產物3 μL進行PCR循環，PCR擴增條件:94℃預變性3 min，94℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72℃ 1 min，擴增 30 個循環，最后 72℃5 min。反應結束后取PCR產物5 μL在2%瓊脂糖凝膠中電泳分析，UVP800型凝膠成像系統成像。

3 Western blotting檢測蛋白表達

p204抗體(sc－13367)購自 Santa Cruz;p21抗體(ab92675)購自Abcam;Tubulin抗體(AT819)購自碧云天;Western blotting marker(CW0021)購自北京康為世紀生物科技有限公司。按藥立波主編的《醫學分子生物學實驗技術》介紹的方法進行蛋白樣品的制備、定量、分離、轉膜、印跡，從而測定特定蛋白的相對含量。

4 MTT檢測細胞活力

四甲基偶氮唑鹽［3－(4，5－dimethylthiazol－2－yl)－2，5－diphenyltetrazolium bromide，MTT］購自 Sigma。收集對數生長期細胞，按細胞數3 000個/孔接種于96孔板，各組干預方法同上述實驗。培養板用平板離心機4 000 r/min離心5 min，充分吸盡上清。每孔加入150 μL DMSO，置旋轉搖床上低速振蕩10 min，酶聯免疫儀490 nm波長檢測各孔吸光度(A)值。

5 流式細胞術檢測細胞周期

細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒(C1052)購自碧云天。按細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒(C1052)說明書操作收集細胞、染色后采用配套軟件進行細胞DNA含量分析和光散射分析。

6 統計學處理

結 果

1 p204在VSMCs的基礎表達和干預因素的影響

1.1 p204在 VSMCs的基礎表達 RT－PCR和Western blotting顯示，p204在VSMCs有一定豐度的基礎表達，見圖1、2。

Figure 1.Effect of intervention factors on the expression of p204 mRNA in VSMCs.IFN:IFN－α induction group;F+I:20%FBS+IFN－α group;N:negative group;C:control siRNA group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.圖1 干預因素對VSMCs p204 mRNA表達的影響

Figure 2.Effect of intervention factors on the expression of p204 protein in VSMCs.IFN:IFN－α induction group;F+I:20%FBS+IFN－α group;N:negative group;C:control siRNA group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.圖2 干預因素對VSMCs p204蛋白表達的影響

1.2 干預因素對p204表達的影響 與N組比較，IFN和F+I組p204 mRNA和蛋白表達上調(P＜0.05)，siRNA組p204mRNA和蛋白表達下調(P＜0.05)，而C組與N組的差異無顯著，見圖1、2和表2。

2 p204表達對VSMCs增殖的影響

2.1 p204表達對VSMCs活力的影響 與N組比較，IFN組、F+I組的MTT吸光度降低(P＜0.05)，siRNA組增高(P＜0.05)，而C組與N組的差異無統計學意義，見表2。

2.2 p204表達對VSMCs細胞周期的影響 與N組比較，IFN和F+I組的G0/G1期細胞增多，S期細胞減少(P＜0.05);siRNA組 G0/G1期細胞減少，S期細胞增多(P＜0.05);C組與N組的G0/G1期和S期細胞比較，差異無顯著，見圖3、表2。

3 p21表達的變化

3.1 p21mRNA水平的變化 RT－PCR結果顯示，IFN組、F+I組的p21 mRNA表達較N組升高(P＜0.05)，siRNA組較N組減少(P ＜0.05)，C組與N組間差異不顯著，見圖4、表2。

表2 誘導p204過表達和沉默對VSMCs增殖和p21表達的影響Table 2.Effect of excessive expression and silencing of p204 on expression of p21 and proliferation of VSMCs(±s.n=3)

表2 誘導p204過表達和沉默對VSMCs增殖和p21表達的影響Table 2.Effect of excessive expression and silencing of p204 on expression of p21 and proliferation of VSMCs(±s.n=3)

IFN:IFN－α induction group;F+I:20%FBS+IFN－α group;N:negative group;C:control siRNA group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.*P ＜0.05 vs negative group.

p21mRNA p21protein N 0.99 ±0.03 0.34 ±0.07 0.67 ±0.06 83.79 ±1.96 1 Group p204 mRNA p204 protein MTT(A value)G0/G1stage(%) S stage(%)0.39 ±1.17 0.45 ±0.06 0.18 ±0.04 C 1.03 ±0.04 0.37 ±0.09 0.66 ±0.03 84.12 ±2.59 10.15 ±1.62 0.46 ±0.08 0.16 ±0.03 IFN 1.88 ±0.07* 0.81 ±0.09* 0.47 ±0.05* 91.33 ±2.09* 7.07 ±1.44* 0.72 ±0.04* 0.38 ±0.03*F+I 1.68 ±0.06* 0.75 ±0.08* 0.53 ±0.06* 89.53 ±2.82* 7.37 ±1.04* 0.70 ±0.07* 0.35 ±0.06*siRNA 0.21 ±0.05* 0.13 ±0.04* 0.88 ±0.04* 78.75 ±1.62* 16.52 ±2.07* 0.21 ±0.03* 0.08 ±0.02*

Figure 3.Effect of p204 expression on cell cycle of VSMCs.IFN:IFN－α induction group;F+I:20%FBS+IFN－α group;N:negative group;C:control siRNA group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.±s.n=3.△P ＜0.05 vs negative group.圖3 p204表達變化對VSMCs細胞周期的影響

Figure 4.Effects of p204 expression on p21 mRNA and protein in VSMCs.IFN:IFN－α induction group;F+I:20%FBS+IFN－α group;N:negative group;C:control siRNA group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.圖4 p204表達變化對VSMCs p21 mRNA和蛋白表達的影響

3.2 P21蛋白水平的變化 Western blotting結果顯示，IFN組、F+I組的p21蛋白表達較N組增多(P＜0.05)，siRNA組較N組減少(P＜0.05)，見圖4、表2。

討 論

血管重塑是血管增殖性疾病的主要病理生理機制，在血管重塑的發生、發展過程中，VSMCs增殖、遷移以及血管基質的改變起著重要作用。

VSMCs的增殖是多階段、多因子參與的精確、有序的調節過程。IFN是一組具有抗病毒、抗增殖、影響細胞生長和分化、調節免疫應答等眾多生物學功能的活性細胞因子家族［7］。IFN與相應受體結合后，通過啟動包括Janus激酶(Janus kinase，JAK)和信號轉導子及轉錄激活子(signal transducer and activator of transcription，STAT)在內的一系列級聯信號放大系統，誘導一系列IFN誘導蛋白的表達，從而發揮其抗病毒、影響細胞增殖等生物學效應［8］。IFN的抗病毒及免疫調節功效已經明確，而其調節細胞生長的功能，如抗增殖、促凋亡或存活、促進衰老和分化及抑制血管生成的作用及機制尚存在爭議［7］。

有研究［9］顯示，IFN－γ可調節細胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin dependent kinase 2，CDK2)/細胞周期蛋白E(cyclin E)的活性及抑制E2啟動子結合因子1(E2 promoter－binding factor 1，E2F－1)基因的表達而阻礙氣道平滑肌細胞的G1/S轉換，從而抑制該細胞的增殖。亦有文獻［10］報道，p204通過不同機制影響骨骼肌細胞、心肌細胞、成骨細胞、軟骨細胞、巨噬細胞的增殖或分化。但p204在VSMCs是否存在基礎表達，對VSMCs增殖有無影響尚無研究報告。本研究結果顯示，大鼠VSMCs存在基礎水平的p204表達，且可被IFN－α誘導過表達，提示VSMCs可能也是p204調控增殖的靶細胞型。進一步研究發現，IFN－α干預可明顯抑制VSMCs增殖，阻滯或延緩VSMCs細胞周期由G0/G1期進入S期;相反，轉染針對p204 mRNA重要功能區域保守序列設計的特異性siRNA可明顯下調p204 mRNA和蛋白水平，并促進VSMCs增殖，上調S期細胞比例，表明p204具有抑制大鼠VSMCs增殖的作用。同時，IFN－α可抑制FBS的促VSMCs增殖作用，并上調p204 mRNA和蛋白表達，也進一步證實IFN－α可通過上調p204表達抑制VSMCs增殖。

p21是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子的CIP/KIP家族成員，是哺乳類動物細胞中第一個被發現的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子，其啟動子上有p53的結合位點，是p53調節轉錄的靶基因。有研究［11］顯示，p21具有抗增殖作用，參與細胞終末分化和衰老的調控。P21的表達除受p53轉錄調節外，也存在非p53依賴信號通路，如p200家族成員p202、STAT 信號轉導通路等［12－13］。本研究結果顯示，無論是誘導p204過表達還是沉默表達，p21的mRNA和蛋白水平均與p204呈一致性變化趨勢。由于p204可通過其200個氨基酸的MF/LHATVAT/S模序介導與53BP1的結合而活化p53，結合本研究結果認為，p204抑制VSMCs和細胞周期進展的作用可能與促進p21表達有關。至于p204是否可通過非p53依賴通路直接與p21相互作用還有待進一步研究。

［1］ 宋 方，吳 強.干擾素誘導蛋白p204調節心肌分化的機制及應用前景［J］.中國細胞生物學學報，2011，33(1):59－64.

［2］ Liu CJ，Wang H，Zhao Z，et al.Myod－dependent induction during myoblast differentiation of p204，a protein also inducible by interferon［J］.Mol Cell Biol，2000，20(8):7024－7036.

［3］ Liu CJ，Wang H，Lengyel P.The interferon－inducible nucleolar p204 protein binds the ribosomal RNA transcription［J］.EMBOJ，1999，18(10):2845－2854.

［4］ Gribaudo G，Riera L，De Andrea M，et al.The antiproliferative activity of the murine interferon－inducible Ifi200 proteins depends on the presence of two 200 amino acid domains［J］.FEBS Lett，1999，456(1):31－36.

［5］ Hertel L，Rollel，De Andrea M，et al.The retinoblastoma protein is an essential mediator that links the interferoninducible 202 gene to cell－cycle regulation［J］.Oncogene，2000，19(32):3598－3608.

［6］ 宋 方，吳 強，陸德琴，等.一套系統培養鼠主動脈血管壁細胞簡單可靠的方法［J］.中國動脈硬化雜志，2011，19(4):361－366.

［7］ Borden EC，Sen GC，Uze G，et al.Interferon at age 50:past，current and future impact on biomedicine［J］.Nat Rev Drug Discov，2007，6(12):975－990.

［8］ Rebouillat D，Hovanessian AG.The human 2'，5'－oligoadenylate synthetase family:interferon－induced proteins with unique enzymatic properties［J］.J Interferon Cytokine Res，1999，19(4):295－308.

［9］ Amrani Y，Tliba O，Choubey D，et al.IFN－γ inhibits human airway smooth muscle cell proliferation by modulating the E2F－1/Rb pathway［J］.Am J Physiol Lung cell Mol physiol，2003，284(6):L1063－L1071.

［10］ Lengyel P，Liu CJ.The p200 family protein p204 as a modulator of cell proliferation and differentiation:a brief survey［J］.Cell Mol Life Sci，2010，67(3):335－340.

［11］ Abbas T，Dutta A.p21 in cancer:intricate networks and multiple activities［J］.Nat Rev Cancer，2009，9(6):400－414.

［12］ 查錫良，藥立波.醫學分子生物學［M］.第1版.北京:人民衛生出版社，2003.460－487.

［13］ Gutterman JU，Choubey D.Retardation of cell proliferation after expression ofp202 accompaniesan increase in p21WAF1/CIP1［J］.Cell Growth Differ，1999，10(2):93－100.