Smad4對小鼠眼瞼發育的影響

劉 瑛，顧欣祖，LU Michael，DING Chuanqing

(1中山大學中山眼科中心，國家重點眼科學實驗室，廣東 廣州 510060;2Department of Ophthalmology and Doheny Eye Institute;3Department of Cell and Neurobiology，Keck School of Medicine，University of Southern California，Los Angeles，CA 90033，USA)

哺乳類動物其眼瞼的發育源自表皮外胚層及其下的眼周中胚層，包括眼瞼特質化、生長、閉合及重開4個連續的過程。小鼠眼瞼的特質化始于E9.0，此時轉錄因子Foxl2表達，確定眼瞼相對于眼球的位置［1］。在E11.5，背側及腹側的眼周外胚層內陷，形成所謂的眼瞼褶(eyelid fold)，此后到E15.5，兩側的眼瞼褶開始相向生長，形成上下瞼。在E15.5左右，上下瞼緣的外表皮層開始向角膜方向延伸，最終于E16.5左右匯合并融合。上下瞼在生后12 d左右開始分離，大約2 d 后眼瞼重新睜開［2－3］。

眼瞼的閉合和重開是所有哺乳類動物的必經之路，眼瞼的正常閉合與開放對于角結膜的發育及維持眼表的健康至關重要，當眼瞼的生長或融合發生缺陷時，便可出現眼瞼在出生時保持開放狀態(eye open at birth，EOB)，眼瞼的閉合涉及到很多基因和信號通路的調控，這些因素的破壞或改變可能都會引起EOB的發生［4］。我們通過對Smad4條件性基因敲除小鼠的研究發現，該基因敲除鼠除了具有小眼球的表型之外也出現了EOB的表型，因此我們進行了更進一步的研究，試圖更深入探討Smad4對眼瞼閉合的影響及其可能的調控機制。我們所采用的Smad4條件性基因敲除鼠借助Cre/LoxP系統，通過Pax6引導的Cre轉基因表達產生的Cre重組酶介導靶基因Smad4兩側的LoxP間發生切除反應，從而獲得特定于眼部某些組織包括眼瞼的Smad4的敲除，以便觀察Smad4對于某些特定組織器官發育的影響。

材料和方法

1 動物

所用動物遵循眼及視覺科學研究動物使用聲明。Smad4fl/fl小鼠由美國南加州大學Dr.Xun Xu實驗室提供，Pax6啟動子控制下的Le－Cre轉基因小鼠來自美國華盛頓大學Dr.David Beebe實驗室，ROSA26報告基因小鼠R26R品系購自Jackson。Le－Cre的小鼠與 Smad4fl/fl小鼠交配產生 Le－Cre/Smad4fl/+小鼠，Le－Cre;Smad4fl/+小鼠繼而再與Smad4fl/fl小鼠交配產生 Le－Cre/Smad4fl/fl小鼠，即我們所需要的條件性Smad4基因敲除小鼠——Smad4 CKO小鼠。Smad4fl/fl小鼠作為對照，即Smad4野生鼠(Smad4 WT)。胎齡以陰部栓子的檢查為基礎確定，該日中午12點為孕0.5，記為E0.5。

2 方法

2.1 組織學檢查 于解剖顯微鏡下獲取適當胎齡的小鼠胚胎觀察其眼瞼變化并拍照，隨后于4%多聚甲醛中4℃固定過夜。梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片7.5 μm厚，常規HE染色觀察形態學。

2.2 免疫組化 石蠟切片常規脫蠟至水，10 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)微波抗原修復，3%甲醇－過氧化氫溶液室溫下孵育10 min阻斷內源性過氧化物酶，5%BSA/0.1%Triton X－100室溫阻斷30 min，抗小鼠 I抗［Smad4、phalloidin(Invitrogen);表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR，1∶100)，c － Jun(1∶100)、p － c － Jun(1∶100，Cell Signaling)］4℃過夜孵育;再用熒光Ⅱ抗(Jackson Immunoresearch)或者 Histostain SP Broad Spectrum(HRP)試劑盒(Invitrogen)并以DAB(Zymed)顯色。

2.3 肌動蛋白的檢測 鋪片及切片染色采用E15.5眼瞼組織或切片，與熒光I抗Alexa Fluor 568 phalloidin(Invitrogen)4℃過夜孵育，封片后鏡檢。

2.4 BrdU標記 (1)配制 BrdU溶液10 g/L，取特定孕期小鼠，稱重，按100 μg BrdU/g BW腹腔注射，1 h后解剖顯微鏡下取胚胎，Carnoy(30%氯仿，10%冰醋酸，60%甲醛)固定液固定過夜;(2)切片經二甲苯與梯度乙醇脫蠟至水，PBST浸洗;(3)3%過氧化氫室溫孵育10 min，PBST浸洗3次，每次5 min;(4)20 mg/L的蛋白酶K于37℃消化18～20 min，PBST浸洗3次，每次5 min;(5)1 mol/L HCl中37℃變性45 min，PBST浸洗3次，每次5 min;(6)Cas block阻斷液孵育30 min，PBST浸洗3次，每次5 min;(7)抗BrdU I抗室溫孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min;(8)余步驟同常規免疫組化。

2.5 TUNEL染色 (1)石蠟切片脫蠟至水;(2)蛋白酶K室溫下孵育10 min;PBST洗2次每次5 min;(3)取100 μL標記液用于陰性對照，按1∶9取標記液和酶液混勻成TUNEL反應液，切片以反應液37℃水浴溫箱避光孵育1 h;PBST洗3次，每次5 min;(4)DAPI工作液孵育3～5 min，PBST洗3次，每次5 min;(5)透明封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并照相。

結 果

1 Le－Cre條件性Smad4基因敲除鼠眼瞼上皮的延伸受損

在E14.5，兩者都表現為同樣的眼瞼開放及外形，無明顯的形態學差別，見圖1 A1、B1。從E15.5后，兩者眼瞼表型出現顯著差別。在野生型小鼠胚，上下瞼緣出現突起，并從突起處開始向相對方向延伸移行，并最終融合，見圖 1 C1、E1、G1、G2。相比之下，變異型小鼠自始至終其瞼緣上皮未見延伸，上下瞼緣也一直未見閉合，眼表一直處于暴露狀態，見圖1 D1、F1、H1、J1。該結果也暗示變異小鼠的 EOB表型是因為眼瞼未能閉合造成，而不是過早的眼瞼開放。

在E14.5左右的野生鼠胚，眼瞼上皮僅由1層基底細胞構成，見圖1 A2，在E15.5左右因為基底細胞的增殖和分化而形成多層結構，此后上下眼瞼的上皮層自其尖端相對移行，兩上皮層在眼表中央相遇而最后融合在一起，見圖1 C2、E2、G2、I2。E14.5的變異鼠胚眼瞼的形態學與同齡野生鼠胚相比并無顯著差異，見圖1 B2，而且在E15.5其眼瞼上皮也增厚而形成多層結構，但其眼瞼上皮層一直未出現延伸，直到出生，其眼瞼始終處于開放狀態，見圖1 D2、F2、H2、J2。

Figure 1.Histological and morphological changes of embryonic eyelids in Smad4 CKO mice(HE，×200).A1，A2:in wild－type embryos at E14.5，upper and lower eyelids kept seperated，and the eyelid epithelium comprised a single layer of basal cells;B1，B2:mutant eyelids at E14.5 appeared similar to wild－type eyelids;C1，C2:at E15.5，eyelid epithelium in wild－type embryos became multilayered and the eyelid epithelial sheet started to extend from both top and bottom eyelid tips;D1，D2:at E15.5，eyelid epithelium in mutant embryos became multilayered but epithelial sheet didn't extend;E1，E2:at E16.0，the eyelid epithelial sheet in wild－type embryos continued to extend，meet and cover the ocular surface;F1，F2:at E16.0，no extension of epithelial sheet was observed;G1，G2:at E16.5，top and bottom eyelids almost fused;H1，H2:no migration of eyelid epithelium was observed;I1，I2:eyelid closure in wild － type newborn;J1，J2:eyelids remained open in mutant newborn.圖1 變異小鼠胚胎眼瞼的組織形態學改變

2 Le－Cre條件性Smad4基因敲除鼠眼瞼上皮細胞內肌動蛋白束形成受損

結果顯示在野生型眼瞼上皮中觀察到明顯的F肌動蛋白束，位于眼瞼上皮層的進行緣，呈環形包繞眼瞼邊界，見圖2 A、B。相反，在變異型其眼瞼上皮前緣未能檢測到此種F肌動蛋白纖維，見圖2 C、D。眼瞼冰凍切片的phalloidin染色也顯示，野生型在其眼瞼上皮層的各層細胞內均有顯著的F肌動蛋白染色，見圖2 E，而在變異型中很少有該肌動蛋白的裝配，見圖2 F。這些結果顯示在Smad4基因敲除鼠胚中，眼瞼未能閉合是因為眼瞼上皮內肌動蛋白束的裝配缺陷所致。

3 Smad4為c－Jun磷酸化及EGFR核轉位所必需

E15.5的野生小鼠胚眼瞼，c－Jun染色存在于瞼緣細胞胞核，見圖3 A，p－c－Jun染色亦呈強陽性，見圖3 C，而變異小鼠有著類似的c－Jun染色模式，見圖3 B，但p－c－Jun染色明顯變弱，而且染色細胞顯著減少，僅有少數靠近瞼結膜的細胞染色陽性，見圖3 D。EGFR染色顯示，在Smad4野生小鼠，EGFR主要存在于瞼緣細胞細胞核內，見圖3 E，而在Smad4變異小鼠，EGFR染色出現在瞼緣細胞的核周胞漿，見圖3 F。我們推測，Smad4在c－Jun的完全活化中起了重要的作用，Smad4的缺失導致其磷酸化過程受損，而無法發揮其足夠的轉錄因子功能;同時受損的還有 EGFR的核轉位，因此可能Smad4在EGF信號通路中也發揮了一定的作用。

4 Le－Cre條件性Smad4基因敲除鼠眼瞼閉合不能與細胞增殖或凋亡無關

在E15.5，TUNEL標記的凋亡細胞在野生型和變異小鼠眼瞼瞼緣無明顯差別，見圖4A、B、C、D，E14.5的BrdU標記在兩者間也相似，見圖3 E、F，因此可推測Smad4的缺失導致的眼瞼閉合不能不涉及細胞增殖的減少或細胞死亡的增加。

Figure 2.Absence of F － actin surrounding the mutant eyelids.A，B:whole mount phalloidin staining of eyelids from a wild－type embryo at E15.5 showed F－actin bundles(white arrowheads)projecting latitudinally around the edge of the eyelids(black arrows);C，D:the F－actin bundles were not present in the eyelids of the Smad4 CKO mutant;E:phalloidin intensely interacted with F－actin in the eyelid epithelium(arrowheads)of the wild－type embryo;F:F－actin bundles were not detected in the eyelid epithelium of the mutant embryo.Scale bar:100 μm.圖2 肌動蛋白在變異眼瞼的缺失

討 論

胚胎發育中眼瞼的閉合通過上皮細胞移行來實現，而眼瞼上皮細胞形態的改變，以及眼瞼上皮內肌動蛋白應力纖維和絲足的形成這些都是上皮細胞移行的關鍵特征［5］。上皮移行一旦受損，將會導致EOB的發生。

Figure 3.Immunohistochemical staining of eyelids(×400).A，B:strong nuclear staining for c－Jun in the eyelids of wild－type(A)and mutant(B)embryos at E15.5，no difference was observed;C，D:staining for embryo:in the Smad4 wild－type embryo，strong nuclear staining was observed in majority of epithelial cells in eyelids(C)，but only a few cells were stained in Smad4 CKO embryo;E，F:staining for EGFR:in the wild － type embryo，staining was found in the nuclei.Perinuclear staining was observed in the eyelid of mutant embryos with weaker immunoreactivity.Scale bar:100 μm.圖3 眼瞼免疫組化染色

基因敲除技術的發展為人們探尋眼瞼閉合的機制提供了一個良好的工具，借此也發現了很多基因敲除鼠可導致EOB表型，如纖維生長因子10(fiber growth factor 10，FGF10)及其受體 FGFR2(fiber growth factor receptor 2)、激活素 β －B、MEK激酶1(MEKK1)、c－Jun N末端激酶(c－Jun N－terminal protein kinase，JNK)、c－ Jun、EGFR 家族成員的 HB－EGF(heparin－binding EGF－like growth factor)和轉化生長因子 α(transforming growth factor α，TGF－α)及其受體EGFR(epidermal growth factor receptor)、叉頭轉錄因子 Foxc1及 Foxc2、骨形態形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)I型受體、BMP 相關的 R － Smads、Wnt拮抗劑 Dkk2 等［4，6－21］，這些信號分子基本上歸屬于3個信號通路:TGFβ/激活素－MEKK1－JNK/p38信號通路、TGFα/EGFR－ERK信號通路及經典的BMP信號通路，因此目前已經明確胚胎眼瞼閉合至少需要3個信號通路的調控，涉及到眾多的基因，這些基因或信號通路的破壞或改變都可能會引起EOB的發生，普遍認為FGF10是眼瞼發育的始動因素，通過調控激活素 β－B、TGFα/HB－EGF以及BMP信號通路來控制眼瞼上皮的增生和移行，從而確保眼瞼的適當發育［4］。

Figure 4.TUNEL staining and BrdU labeling of eyelids(×400).TUNEL staining in the eyelid epithelium of Smad4 wild－type(A，B)and CKO(C，D)embryos at E15.0 showed no difference in the number of apoptotic cells.BrdU labeling in the eyelid epithelium of Smad4 wild－type(E)and CKO(F)embryos at E14.5 also showed no difference in the number of BrdU－labeled cells.Scale bar:100 μm.圖4 眼瞼凋亡染色及BrdU標記

有研究表明，在眼瞼發育過程中，眼瞼間質內的FGF10向眼瞼外胚層發出信號，后者增殖并動員表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和激活素(activin)信號通路，而后再激活ERK或MEKK1－JNK信號級聯通路，從而控制細胞骨架的重組，如誘導肌動蛋白絲形成肌動蛋白束像壓力纖維(stress fiber)，這種纖維在推動上皮層的運動中起主要作用，因此在眼瞼的融合過程中，肌動蛋白重組是眼瞼融合過程中細胞遷移所必需而且關鍵的一個細胞活動［4－5］。我們的結果提示在 Smad4基因敲除鼠胚中，眼瞼未能閉合是因為眼瞼上皮內肌動蛋白束的裝配缺陷所致。

c－Jun是眼瞼閉合的關鍵調控因素，其磷酸化不僅為BMPs信號通路和TGFβ/激活素－MEKK1－JNK信號通路所必需，而且對于TGFα/EGFR－ERK信號通路的激活有誘導作用，在眼瞼閉合的分子機制中不可或缺［4－7］。Huang 等［4］在他們最新的研究中發現，FGF調控的BMP信號通路在眼瞼閉合中發揮必需的作用，他們的結果提示BMPs通過經典的R－Smad/Smad4通路，與激活素 β－B通路共同促進c－Jun的最大磷酸化并介導磷酸化p－c－Jun的核轉位，同時該信號通路還激活了眼瞼閉合所必需的轉錄因子Foxc1和Foxc2的表達，從而調控眼瞼發育的閉合過程。他們還認為FGF調控的TGF α通路與BMP信號通路之間也存在偶合，且激活素 β－B，TGFα/HB －EGF，音猬因子(Sonic Hedgehog，Shh)以及BMP信號通路形成了一個復雜的調控網絡，確保瞼緣上皮細胞的適當遷移和融合。

與Huang等的研究類似，我們也在Le－Cre特異性Smad4基因敲除鼠中觀察到了EOB表型，這種EOB表型并非是眼瞼的過早開放，也與細胞增殖或細胞凋亡的異常無關，而是Smad4在眼瞼上皮細胞失活后，眼瞼上皮細胞肌動蛋白束合成缺陷，上皮細胞移行受影響，從而導致了眼瞼融合缺陷。我們也發現Smad4對c－Jun磷酸化有影響，但并不影響c－Jun本身的核表達。與Huang等發現p－c－Jun在Smad4變異小鼠眼瞼上皮細胞核周表達不同，我們發現雖然磷酸化c－Jun的表達明顯降低，陽性細胞數減少，但其表達仍存在于少數細胞核內，這意味著磷酸化c－Jun的核轉位并未受到影響，僅Smad4失活不足以完全抑制c－Jun磷酸化，應該存在其它信號通路調控c－Jun的磷酸化，這與Zhang等［21］的研究結果相似，他們認為c－Jun的磷酸化和功能部分依賴于激活素β－B的非Smads依賴信號通路，同時也與眼瞼融合受多個信號通路調控相吻合。我們還觀察到EGFR在Smad4變異小鼠眼瞼上皮的表達發生改變，Smad4失活后，EGFR未能出現在核內，而是位于核周胞漿，且表達減弱。有研究發現，在眼周皮膚的移行中，EGF家族成員通過激活ERK信號通路而促進眼周皮膚的移行，而EGF級聯上游的c－Jun 磷酸化可上調 EGFR － ERK 通路［5，21］;Li等［6］及Zenz等［7］的研究又表明，c－Jun在表皮的失活可影響EGFR信號通路的激活，因此我們推測Smad4的失活可能也同時影響了EGFR信號通路，亦或與c－Jun磷酸化改變有關，而且Smad4可能不止在控制眼瞼閉合的某一個信號通路中起信號轉導作用，而是介入了多個信號通路，從而調控肌動蛋白應力纖維的裝配和眼瞼上皮的移行。

眼瞼發育的調控是一個相當復雜的過程，涉及眾多信號通路，構成一個復雜的網絡，需要進一步的研究來完全闡明這些通路的功能及相互作用，這些研究不但有利于我們對眼瞼融合更全面的認識，而且對于我們理解其它依賴于上皮融合的形態學發生如神經管、視裂、晶體泡及顎架也大有裨益，同時對于尋找上皮性損傷的修復機制及治療手段有所借鑒。

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