孕酮調節乳腺癌耐藥蛋白的機制研究*

張玉華，李 光，俞 進，徐妙生，李洪利

(首都醫科大學附屬北京天壇醫院病理科，北京 100050)

乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP/ABCG2/MXP)是一種近來新發現的多藥耐藥蛋白，屬于ATP結合盒(adenosine triphosphate－binding cassette，ABC)膜轉運蛋白超家族［1－2］。作為細胞膜上的藥物排出泵，可將細胞毒性藥物轉運至胞外，BCRP的過表達可以導致腫瘤細胞對多種化療藥物產生耐藥［3－5］。而新近對BCRP基因啟動子的研究發現，在BCRP啟動子的上游5'端的區域具有正性和負性調控區域，并發現存在一個孕激素反應元件(progesterone response element，PRE)［6－8］。該反應元件與乳腺癌細胞中BCRP的表達密切相關，因此孕激素可能通過與BCRP啟動子上游的PRE結合，調控BCRP基因的表達。近期的研究也顯示了一些能夠調節BCRP表達的藥物，其中包括雌激素的類似物和拮抗劑，但目前對孕激素調控BCRP的具體機制及作用效應尚不明確。因此，本實驗選擇孕激素和BCRP基因為研究對象，通過藥物誘導或基因轉染的方法，建立由BCRP啟動子或巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)啟動子啟動表達BCRP的4種耐藥細胞系。將孕酮(progesterone，P4)加入耐藥細胞系的培養液中，觀察其對不同細胞系BCRP表達的影響，并深入探討孕酮對BCRP基因的效應和可能的分子調控機制。

材料和方法

1 材料

1.1 細胞株 人乳腺癌細胞株PR陽性的T47D和PR陰性的MDA－MB－231由中國醫學科學院提供，均來源于美國國立癌癥研究所(National Cancer Institute)。

1.2 主要試劑 Progesterone、RU486、G418及四甲基偶氮唑鹽［3－(4，5－dimethythiazol－2－yl)－2，5－diphenyltetrazolium bromide，MTT］均購自Sigma;pcDNA3載體由本實驗室保存;質粒提取試劑盒為Qiagen產品;LipofectamineTM2000試劑盒購自Invitrogen;Trizol reagent和RT－PCR kit為TaKaRa產品;BCRP抗體(BXP－53)購自Abcam;辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgGⅡ抗購自北京中杉生物技術公司;DMEM和胎牛血清為Gibco產品;引物由上海生工生物公司合成;米托蒽醌(mitoxantrone，MX)購自江蘇恒瑞制藥股份有限公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)為啟光試劑公司產品。

2 方法

2.1 細胞培養 人乳腺癌細胞株孕酮受體(progesterone receptor，PR)陽性的T47D和PR陰性的MDA－MB－231在含有10%胎牛血清及青霉素、鏈霉素各105U/L的DMEM培養液中常規培養(37℃、5%CO2)。0.25%胰酶(含0.02%EDTA)混合液消化，每2～3 d傳代1次，取對數生長期細胞進行實驗。

2.2 米托蒽醌誘導耐藥細胞系T47D/MX和MDA－MB－231/MX的建立 米托蒽醌誘導篩選乳腺癌細胞T47D和MDA－MB－231，在含有10%胎牛血清的DMEM培養液中加入米托蒽醌，首先起始濃度為8 μg/L，細胞傳3代后，逐漸增加米托蒽醌的篩選濃度至 20 μg/L、40 μg/L、80 μg/L 和 100 μg/L［9］，最終建立由BCRP啟動子啟動表達BCRP的2種耐藥細胞系:PR陽性的T47D/MX和PR陰性的MDA－MB－231/MX。

2.3 脂質體Lipofectamine 2000介導質粒轉染乳腺癌細胞建立T47D/CMV－BCRP和MDA－MB－231/CMV－BCRP耐藥細胞系 重組質粒pcDNA3－CMV－BCRP含有CMV啟動子和野生型BCRP基因，由美國Marryland大學的Douglas Ross教授惠贈，本實驗室保存。將質粒pcDNA3－CMV－BCRP轉染PR陽性的T47D和PR陰性的MDA－MB－231乳腺癌細胞系，并經350 mg/L G418篩選后，建立由CMV啟動子啟動表達BCRP的2種耐藥細胞系:PR陽性的T47D/CMVBCRP和PR陰性的MDA－MB－231/CMV－BCRP。這2種細胞作為對照。

2.4 不同藥物處理細胞 T47D/MX、T47D/CMV－BCRP、MDA－MB－231/MX和MDA－MB－231/CMV－BCRP 4種細胞株按常規方法培養。選對數生長期細胞用于實驗，每株調整細胞數為2×105接種于24孔板，每組設3個平行復孔。實驗分組:(1)空白組:只加細胞不加藥物;(2)孕酮單獨作用組:細胞接種 24 h后，加入不同濃度(10－7mol/L 、10－6mol/L、10－5mol/L)的孕酮繼續培養96 h;(3)孕酮和RU486聯合作用組:細胞接種24 h后，加入10－5mol/L孕酮，48 h后再加入10－5mol/L RU486，繼續培養48 h。藥物和培養基每24 h更換1次，72 h后收集細胞進行檢測。

2.5 RT－PCR檢測BCRP mRNA的表達水平 UNIQ－10柱式總RNA抽提試劑盒提取實驗組和對照組細胞的總RNA，紫外分光光度儀測定260 nm和280 nm波長的吸光度值(A)，計算 RNA純度(A260/A280=1.8～2.0)及 RNA 含量。根據引物分析軟件自行設計:BCRP引物正義鏈5'－TGGCTGTCATGGCTTCAGTA －3'，反義鏈5'－GCCACGTGAT TCTTCCACAA－3'，擴增片段為235 bp;內參照GAPDH引物正義鏈5'－CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT －3'，反義鏈 5'－AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC －3'，擴增片段為 307 bp。逆轉錄體系為20 μL，其中含4 μg RNA 樣本，1 μL 隨機引物，2 μL dNTP混合物，1 μL逆轉錄酶，反應條件為30℃ 10 min，45℃ 30 min，99℃ 5 min。隨后產物進行PCR擴增，反應體系為 100 μL，其中逆轉錄產物5 μL，Tap 酶0.5 μL(5 ×106U/L)，BCRP上、下游引物各 10 μL，GAPDH 上、下游引物各 10 μL。95 ℃預變性3 min，94 ℃ 5 min，95 ℃ 50 s，52 ℃ 30 s，72℃ 1 min，循環32次，72℃5 min。取PCR產物20 μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統分析，BCRP指數=BCRP灰度值/GAPDH灰度值，該指數與BCRP mRNA的量成正比，進行BCRP mRNA表達水平的半定量分析。

2.6 Western blotting檢測BCRP蛋白的表達變化 各組細胞加入細胞裂解液，按常規方法提取細胞總蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。取50 μg蛋白變性、電泳、轉至硝酸纖維素膜，麗春紅染色，5%脫脂牛奶封閉，洗膜后加Ⅰ抗BCRP(1∶1000)或GAPDH(1∶5000)4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶(HRP)標記的Ⅱ抗IgG(1∶4000)孵育2 h，ECL化學發光試劑盒于暗室自顯影。實驗以GAPDH為參照，采用BandScan 5.0軟件測量特異條帶的灰度值，以目的條帶的灰度值與對應GAPDH灰度值之比表示BCRP蛋白的含量。

2.7 米托蒽醌外排實驗檢測BCRP的轉運功能 米托蒽醌是BCRP特異性轉運的熒光物質，當實驗細胞的BCRP轉運功能降低時，米托蒽醌在細胞內聚集，熒光強度高于耐藥細胞［9］。常規胰酶、EDTA消化各組細胞，制備細胞懸液并轉移至24孔板。細胞培養在含10%胎牛血清的完全培養基DMEM或含有20 μmol/L米托蒽醌和10%胎牛血清的DMEM培養基中，37℃、5%CO2培養箱中孵育30 min。收集實驗組和對照組細胞，流式細胞儀檢測細胞內米托蒽醌的熒光強度。

3 統計學處理

數據采用SPSS 16.0統計軟件進行分析處理。每次實驗相同條件重復3次，實驗數據以均數±標準差()表示。多樣本均數之間的比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 孕酮對不同細胞組BCRP基因mRNA表達的影響

RT－PCR結果顯示，與未處理組相比，孕酮以劑量依賴方式增強BCRP mRNA的表達，孕酮處理組在濃度10－7、10－6和10－5mol/L時，T47D/MX細胞中BCRP mRNA的條帶明顯增強，表達水平上調，分別是未處理組的2.64倍(P＜0.05)、4.71倍(P ＜0.05)和 7.95倍(P ＜0.01)倍，見圖 1A;10－5mol/L孕酮和10－5mol/L RU486聯合處理組，T47D/MX細胞中BCRP mRNA的表達水平顯著低于10－5mol/L孕酮單獨處理組(處理前后相對BCRP mRNA表達率:231.8% ±2.4%vs 74.9% ±1.3%，P＜0.01)，見圖1A。這提示孕酮對 BCRP mRNA表達的增強效應，可被其拮抗劑RU486阻斷，兩藥之間存在拮抗作用。而對照組T47D/CMV－BCRP細胞，處理前后細胞中BCRP mRNA的表達水平無明顯差異(P＞0.05)，見圖1B;且對照組MDA－MB－231/MX和MDA－MB－231/CMV－BCRP細胞，各組處理前后相比，BCRP mRNA表達量無明顯變化，差異無統計學意義(P＞0.05)。

2 孕酮對不同細胞組BCRP蛋白表達的影響

Western blotting結果顯示，與未處理組相比，10－7、10－6和10－5mol/L孕酮以劑量依賴方式增強T47D/MX細胞中BCRP蛋白的表達，增加倍數分別為1.94(P＜0.05)、4.65(P＜0.05)和7.02(P ＜0.01)，見圖 2A;10－5mol/L 孕酮和 10－5mol/L RU486聯合處理組，T47D/MX細胞中BCRP蛋白的相對表達水平為46.2% ±1.3%，明顯低于10－5mol/L孕酮單獨處理組(相對 BCRP蛋白表達率:147.9% ±3.2%，P＜0.01)，見圖2A，兩藥之間存在拮抗作用。而對照組T47D/CMV－BCRP細胞，處理前后細胞中BCRP蛋白的相對表達水平無明顯差異(P＞0.05)，見圖2B;且對照組MDA－MB－231/MX和MDA－MB－231/CMV－BCRP細胞，處理方法同前，各組處理前后相比，BCRP蛋白的含量無明顯改變，差異無統計學意義(P＞0.05)。

3 孕酮對不同細胞組BCRP轉運功能的影響

米托蒽醌是BCRP的特異性轉運底物，常用于檢測BCRP的外排功能。米托蒽醌外排實驗結果顯示，與未處理組相比，10－5mol/L孕酮單獨處理組，T47D/MX細胞內米托蒽醌熒光強度顯著降低，峰值左移，見圖3A，外排米托蒽醌的能力升高了41.7%(處理前后相對米托蒽醌熒光強度:100.0%，141.7% ±6.4%，P ＜0.05)，見圖 3A、表1;10－5mol/L 孕酮和10－5mol/L RU486聯合處理后，T47D/MX細胞內的米托蒽醌熒光強度明顯高于孕酮單獨處理組，峰值右移，見圖3A，外排米托蒽醌的能力降低了20.3%(處理前后相對米托蒽醌熒光強度:141.7% ±6.4%vs 112.9% ±5.2%，P ＜0.05)，見圖3A、表1，兩藥之間存在拮抗作用;而對照組T47D/CMV－BCRP、MDA－MB－231/MX和MDA－MB－231/CMV－BCRP細胞，各組處理前后相比，細胞中米托蒽醌熒光強度無明顯改變(P＞0.05)，見圖3B、表1。

Figure 1.Effects of progesterone on BCRP mRNA expression in T47D/MX and T47D/CMV－BCRP cells..n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control(0 mol/L P4+0 mol/L RU486);##P＜0.01 vs 10－5mol/L P4+10－5 mol/L RU486.圖1 孕酮對T47D/MX和T47D/CMV－BCRP細胞BCRP mRNA表達的影響

討 論

Figure 2.Effects of progesterone on BCRP protein expression in T47D/MX and T47D/CMV－BCRP cells..n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control(0 mol/L P4+0 mol/L RU486);##P＜0.01 vs 10－5mol/L P4+10－5 mol/L RU486.圖2 孕酮對T47D/MX和T47D/CMV－BCRP細胞BCRP蛋白表達的影響

BCRP是新近發現的與腫瘤多藥耐藥相關的一種跨膜轉運蛋白，與P－糖蛋白(P－glycoprotein，P－gp)同屬于ABC轉運蛋白超家族。ABC轉運蛋白是一種能量依賴性藥物排出泵，消耗ATP將細胞內的藥物泵出，減少細胞內藥物濃度，降低藥物對腫瘤的殺傷作用。高表達BCRP的腫瘤細胞株對米托蒽醌、阿霉素、柔紅霉素等多種化療藥物可產生交叉耐藥［3－5］，該蛋白在多藥耐藥方面逐漸引人關注。人類的BCRP基因首次在乳腺癌耐藥細胞株MCF－7/AdrVp的DNA文庫中發現而命名，定位于染色體4q22區域，含有1個開放閱讀框架。BCRP基因的轉錄產物mRNA長約2.4 kb，編碼655個氨基酸殘基、72.6 kD的蛋白質。BCRP蛋白僅含有1個跨膜區域和1個ATP結合位點，在空間結構上僅相當于完全轉運蛋白P－gp分子的一半，故稱為半轉運蛋白［10］。因此，有學者認為BCRP是耐藥蛋白的基本結構，了解BCRP的作用機制對于研究其它耐藥蛋白大有幫助。

近來有研究報道，孕激素、雌激素的類似物或拮抗劑可以逆轉K562/BCRP細胞中BCRP介導的多藥耐藥，如孕酮、雌二醇、三苯氧胺［11－12］，其機制可能是作為BCRP的底物，競爭性抑制BCRP與其它抗腫瘤藥物結合。2004年，Ee等［7］發現在BCRP基因啟動子區的5'端側翼序列的－243至－115之間含有1個雌激素反應元件(estrogen response element，ERE)結構，該反應元件與乳腺癌細胞中BCRP的表達密切相關。而最新分析認為［8］，胎盤絨毛膜細胞癌中BCRP啟動子區的ERE同時也是一個PRE，孕酮可能通過PR與BCRP啟動子區的PRE相結合，增強BCRP的表達。關于孕激素對BCRP基因的具體作用機制及影響，以往的研究報道缺乏一致性結果。因此，孕激素及其受體在BCRP表達調控中的作用過程、影響因素及綜合效應目前尚不十分清楚。

我們前期實驗顯示，托瑞米芬可通過ERα介導抑制BCRP基因的啟動子而減弱BCRP轉錄活性，降低ERα陽性乳腺癌細胞中BCRP mRNA和蛋白的表達水平，進而逆轉BCRP 介導的多藥耐藥［13］。

本實驗通過藥物誘導和基因轉染的方法，作用于孕激素受體陽性的T47D和PR陰性的MDA－MB－231乳腺癌細胞系，成功建立了分別由含PRE的BCRP啟動子和不含PRE的CMV啟動子啟動表達BCRP的4種耐藥細胞系T47D/MX、T47D/CMV－BCRP、MDA－MB－231/MX和MDA－MB－231/CMV－BCRP，觀察孕酮對不同的乳腺癌耐藥細胞系BCRP表達的影響，尚未見相關報道。

本研究結果發現，孕酮能夠在轉錄水平明顯增強T47D/MX細胞中BCRP mRNA的表達，但卻不能抑制T47D/CMVBCRP、MDA－MB－231/MX和MDA－MB－231/CMVBCRP細胞中BCRP mRNA的表達水平。分析存在差異的原因:前者T47D/MX細胞中BCRP的表達是由含PRE的BCRP啟動子啟動表達，且細胞是PR陽性的;而后者T47D/CMVBCRP細胞中BCRP表達是由不含PRE的CMV啟動子啟動表達;且 MDA－MB－231/MX和 MDA－MB－231/CMVBCRP細胞是PR陰性的。這提示，孕酮不是作為BCRP的底物調節其功能，而可能是通過PR的介導與BCRP啟動子區的PRE序列結合，激活BCRP基因啟動子而增強BCRP基因mRNA的轉錄。本研究通過Western blotting測定了BCRP蛋白的表達水平，米托蒽醌外排實驗檢測了BCRP的轉運功能。結果顯示，孕酮顯著上調PR陽性乳腺癌細胞中BCRP蛋白的表達，明顯升高細胞外排米托蒽醌的能力。

然而，由于PR亞型PRA和PRB受體的存在，并可通過PRE與AP1位點2種方式介導信號轉導，使得PR介導的信號轉導過程更為復雜。在孕酮調控BCRP的過程中，是以某一種信號轉導通路為主還是幾種信號轉導通路共同發揮作用?幾種信號轉導通路之間是否存在相互影響?尚未見報道，將成為今后深入研究的方向。

Figure 3.Effects of progesterone on the intracellular accumulation of mitoxantrone in T47D/MX and T47D/CMV －BCRP cells.圖3 孕酮對T47D/MX和T47D/CMV－BCRP細胞BCRP轉運功能的影響

表1 孕酮對各組細胞BCRP外排米托蒽醌的影響Table 1.Effects of progesterone on BCRP－mediated mitoxantrone efflux activity

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