黃芩莖葉黃酮對慢性腦缺血大鼠腦內NMDA受體和VEGF表達的影響*

王玉梅，劉永平，曹 凱，秦博文，商亞珍

(河北省重要研究與開發重點實驗室/承德醫學院中藥研究所，河北 承德 067000)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是由腦血管因素導致腦組織損害引起的癡呆綜合征，包括缺血性腦血管病、出血性腦血管病以及急性或慢性缺氧性腦血管病引起的癡呆，是老年期癡呆病中最常見的類型之一［1］。嚴重影響患者的身心健康，給家庭、社會造成了沉重負擔。隨著醫藥工作者對VD的認識和研究的不斷深入，發現興奮性氨基酸及其受體的激活以及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的生成都與VD的發生、發展和預后密切相關［2］。引起神經元死亡的興奮性毒性理論已成為腦缺氧缺血性損傷的主要學說，而VEGF促進血管的生成對腦缺血后血管重建及神經功能的恢復起重要作用。

黃芩莖葉黃酮(Scutellaria baicalensis Georgi stem flavonoids，SSF)是從中藥黃芩地上部分提取分離的黃酮類化合物，其多羥基結構具有較強的還原性，對神經損傷有很好的保護作用。我們的前期工作已經證明SSF具有抗炎、抗氧化、抗缺氧和改善記憶障礙等作用［3－6］。本實驗采用大鼠雙側頸總動脈結扎模型，探討SSF對慢性腦缺血大鼠海馬細胞中N－甲基－D－天門冬氨酸受體(N－methyl－D－aspartate receptor，NMDAR)和皮層細胞中VEGF表達的影響。

材料和方法

1 動物和試劑

健康雌性SD大鼠60只(購于河北醫科大學實驗動物中心，合格證編號為90912)，300～320 g;SSF由承德醫學院中藥研究所制備;引物由上海生工公司合成，NMDAR1(498 bp)上游引物5'－GCAGTAAACCAGGCCAATAAGCG －3'，下游引物5'－CTCCATCAGCAGAGCCGTCACAT－3';NMDAR2A(459 bp)上游引物5'－TGGAGATGACACGGACCAGGAG －3'，下游引物 5’－AAATCATAGCCAGTGAGGCCGAG－3';NMDAR2B(314 bp)上游引物 5’－GAACGAAACTGACCCAAAGAGC－3'，下游引物 5’－CAGGGAA GTAGGTGGTGACGAT－3';VEGF(462 bp)上游引物5'－CTGTACCTCCACCATGCCAAG －3'，下游引物5'－ACAAGGCTCACAGTGAACGC－3';β－actin(207 bp)上游引物 5'－CACCCGCGAGTACAACCTTC －3'，下游引物 5'－ CCCATACCCACCATCACACC － 3';TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(100次量)購于大連寶生物工程有限公司。

2 大鼠慢性腦缺血模型制備

大鼠仰臥位固定在手術臺上，頸內部去毛、強力碘消毒后沿頸正中切開，分離雙側頸總動脈，并套以“0”號線。待動物清醒后結扎雙側頸總動脈。術前稱重并腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)進行麻醉。術中保證大鼠能自主呼吸，術后每只動物腹腔注射8×104U青霉素鈉預防細菌感染。待大鼠完全清醒后送至溫度為22℃ ±1℃的動物房飼養，觀察;做同樣手術操作但不結扎雙側頸總動脈作為假手術組。術后30 d利用水迷宮進行模型篩選，成模率為75%。在手術后第35 d，將造模成功的大鼠隨機分為4組:模型組，17.5 mg·kg－1·d－1、35 mg·kg－1·d－1和 70 mg·kg－1·d－1SSF 3個劑量給藥組，每組8只。實驗動物連續灌胃給藥38 d后取材，假手術組和模型組灌胃等體積生理鹽水。

3 腦組織細胞中 NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B和VEGF的檢測

采用RT－PCR法檢測海馬細胞中 NMDAR1 mRNA、NMDAR2A mRNA、NMDAR2B mRNA和皮層細胞中 VEGF mRNA的含量。各組大鼠在術后72 d，末次灌胃給藥60 min后，乙醚麻醉，斷頭冰上取腦，分離海馬和皮層并保存于－80℃冰箱中。分別提取海馬和皮層細胞中RNA，用DU800紫外可見分光光度計測定RNA濃度和純度。嚴格按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0 試劑盒說明書進行反轉錄和PCR反應，PCR反應結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠于紫外透射儀中確認PCR反應產物并攝取圖像。利用Quantity One 4.6.2軟件進行定量分析，以目的條帶的吸光度值與β－actin條帶吸光度值的比值，作為各目的基因mRNA表達的相對水平。

4 統計學處理

結 果

1 SSF對慢性腦缺血大鼠海馬細胞中 NMDAR1、NMDAR2A和NMDAR2B表達的影響

結果顯示，雙側頸總動脈結扎2個月可使大鼠海馬細胞中NMDAR1、NMDAR2A和NMDAR2B的mRNA表達明顯增加，灌胃給予 SSF 17.5 mg·kg－1·d－1、35 mg·kg－1·d－1和70 mg·kg－1·d－1治療38 d可不同程度降低大鼠海馬細胞中NMDAR1、NMDAR2A和NMDAR2B mRNA的表達。與假手術組相比，慢性腦缺血大鼠海馬中NMDAR1、NMDAR2A和NMDAR2B mRNA的表達分別增加了75.86%、75.68% 和84.14%(P＜0.01);而3個劑量SSF可不同程度地降低NMDAR1、NMDAR2A和NMDAR2B mRNA的表達，分別降低了10.48%、7.92% 和 13.04%(17.5 mg·kg－1SSF，P ＜0.05)，28.43%、26.09%和 28.67%(35 mg·kg－1SSF，P ＜0.01)，36.24%、39.72% 和 39.80%(70 mg·kg－1SSF，P ＜0.01)，見圖1。

2 SSF對慢性腦缺血大鼠皮層細胞中VEGF表達的影響

皮層細胞中VEGF的RT－PCR結果顯示，雙側頸總動脈結扎2個月可使大鼠皮層中VEGF mRNA的表達增加了18.57%，具有統計學意義(P＜0.01)。灌胃給予SSF 17.5 mg·kg－1·d－1、35 mg·kg－1·d－1和70 mg·kg－1·d－1治療38 d可不同程度增強慢性腦缺血模型組大鼠皮層中VEGF mRNA的表達，分別增加了11.95%(17.5 mg·kg－1SSF，P＜0.05)、16.70%(35 mg·kg－1SSF，P ＜0.01)和 33.09%(70 mg·kg－1SSF，P ＜0.01)，見圖2。

討 論

Figure 1.The expression of NMDAR1，NMDAR2A and NMDAR2B mRNA in hippocampus of chronic cerebral ischemia rats.M:marker..n=6.##P＜0.01 vs sham group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model group.圖1 SSF對慢性腦缺血大鼠海馬細胞中NMDAR1、NMDAR2A和NMDAR2B表達的影響

Figure 2.The expression of VEGF mRNA in hippocampus of chronic cerebral ischemia rats.M:marker..n=6.##P＜0.01 vs sham group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.圖2 SSF對慢性腦缺血大鼠皮層細胞中VEGF表達的影響

中樞內的興奮性氨基酸是維持正常腦功能，包括學習、記憶、運動、認知和發育等所必需的，如果含量過高，會作為一種神經毒素引起神經細胞腫脹和空泡變性，甚至導致神經細胞死亡［7］。近年來，引起神經元死亡的興奮性毒性理論已成為腦缺氧缺血損傷的主要學說。在中樞神經系統中，神經元之間的信息傳遞通過突觸來完成。在突觸前神經元所釋放的不同神經遞質的作用下，引起突觸后神經元或去極化使其興奮，或超極化使其抑制［8］。興奮性氨基酸(excitatory amino acid，EAA)是腦內含量最高且能使神經元興奮的一類酸性氨基酸神經遞質，包括天門冬氨酸和谷氨酸兩種，與之相對應的受體分為兩大類，離子型EAA受體和代謝型EAA受體。離子型EAA受體包括NMDA受體、α－氨基－3－羥基－5－甲基－4－異噁唑－丙酸受體和海人酸受體［9］。NMDA受體是目前研究最為深入的興奮性氨基酸受體，也是哺乳動物中樞神經系統主要的EAA受體之一，參與中樞神經許多重要的病理生理過程［10－11］。NMDA受體是一種對 Ca2+高度通透的配體電壓門控鈣離子通道受體，現已克隆出兩類NMDA受體的亞單位，一類為 NMDAR1(NR1)，一類為NMDAR2(NR2);NMDAR2又分為 NMDAR2A、NMDA2B、NMDAR2C和NMDAR2D四個亞基，各亞基在不同區域表達有所不同。NR1和NR2A分布廣泛，NR2B主要存在于前腦，NR2C多居于小腦，NR2D含量相對較少［12］。NR1是功能亞單位，它自身或與NR2亞單位聚合形成的通道復合體都具有NMDA受體的全部功能特性，而NR2是調節亞單位，它本身不具有NMDA受體的功能活性，但與NR1聚合共表達時可影響NR2的功能活性。要形成有功能的NMDA受體通道，需要組合NR1及NR2亞單位中的一個亞基。新生鼠海馬以NR2B和NR1 mRNA表達為主，NR2A mRNA水平很低，此后NR2A隨著發育持續增長。成年大鼠海馬中以NR1/NR2B/NR2A三聚體的NMDA受體復合物形成最多，而NR1/NR2B和NR1/NR2A含量次之［13］。研究表明，NMDA受體與突觸可塑性、學習記憶、神經損傷、癲癇狀態、老年性癡呆癥等密切相關［14］。在正常靜息情況下，NMDA受體的離子通道內存在Mg2+，能阻斷Ca2+內流。該受體的激活至少需要3個信號:甘氨酸與NMDA受體結合，谷氨酸與NMDA受體結合，膜去極化。在病理情況下，如缺血/缺氧、低血糖和持續性抽搐等，細胞外谷氨酸就會增加，可達正常的數倍至幾十倍，突觸間隙過度增加的谷氨酸刺激谷氨酸受體，啟動一系列神經細胞損害的病理生化反應，其中包括兩個明顯不同的過程:一是由非NMDA受體過度興奮所介導的神經細胞急性滲透性腫脹，可在數小時內發生，以Na+內流，隨即Cl－和H2O被動內流為特征;二是由NMDA受體過度興奮所介導的神經細胞遲緩性損傷，可于數小時至數日發生，以 Ca2+內流為特征［15］。并能導致蛋白酶、核酸內切酶的激活、NO的生成、自由基的產生以及線粒體膜滲透性的改變，從而導致神經元的損傷和死亡。因此，NMDA受體介導的神經興奮性毒性在缺血性腦損傷中起關鍵作用［16］。劉永等［17］研究證明NMDA受體活性的持續上調，將導致胞外Ca2+大量持續內流，引起胞內Ca2+超載，激活多種蛋白激酶，并進一步導致受體上調，最終引起遲發性神經元損傷。本實驗采用RT－PCR法檢測海馬細胞中NMDAR1、NMDAR2A和NMDAR2B mRNA的表達情況，結果發現雙側頸總動脈結扎2個月后，模型組大鼠海馬細胞中NMDAR1、NMDAR2A和NMDAR2B mRNA的含量均顯著上升，而SSF 3個藥物組治療38 d，能不同程度地降低模型組大鼠海馬細胞中NMDAR1 mRNA、NMDAR2A mRNA和NMDAR2B mRNA的含量，從而減少興奮性氨基酸與受體結合產生的毒性作用，減輕腦缺血損傷。

缺血缺氧可造成不同程度的神經系統損害，保護腦免于損害機制之一是增加和改善腦的血流，而新生血管形成則有助于增加組織供血和供氧，對抗缺血缺氧和促進組織修復。近年來大量研究發現，VEGF與腦組織缺血損傷密切相關，腦缺血在一定時間內，腦組織通過血管新生代償性地促進神經組織結構與功能的恢復。在正常腦組織中僅有少量VEGF蛋白表達，在腦缺血發生時，缺血、低氧作為一種信號激活VEGF/VEGFR系統，促使VEGF蛋白表達升高，特別在海馬、皮質對缺血敏感的神經元［18］。近年陸續報道，VEGF不僅可以誘導內皮細胞的增殖、促進微血管的形成，還能直接作用于多種類型的神經細胞發揮神經營養及神經保護作用［19－20］。在本實驗中，腦缺血模型組大鼠和SSF 3劑量藥物組大鼠腦組織中VEGF蛋白表達均較假手術組增加，且SSF 3劑量藥物組VEGF蛋白表達又較腦缺血模型組明顯增加。本實驗結果表明大鼠腦缺血88 d，腦缺血作為一種刺激信號，可代償性地促進VEGF的生成，反饋調節慢性腦缺血引起的神經損傷，而3劑量SSF能夠進一步促進VEGF的蛋白表達，增加神經組織中VEGF的水平，增加血管通透性，促進血管生成，建立側支循環，從而恢復神經營養、抑制神經細胞凋亡，達到神經保護作用。

本實驗結合以往的研究工作，SSF多羥基結構具有較強的還原性，可通過自身氧化，降低膜脂質過氧化反應，保證細胞膜的完整性和通透性;降低有慢性腦缺血引起的NMDA受體的含量，減少了興奮性氨基酸與NMDA受體的結合，降低了鈣通道開放，降低了由于鈣離子內流而引起的細胞內鈣超載，從而降低了神經興奮性毒性引起的神經損傷。同時SSF還能增強腦缺血大鼠腦內VEGF的蛋白表達，促進血管新生，建立側支循環，從而抑制神經細胞凋亡和神經損傷。提示SSF對缺血性神經損傷的保護作用源于對腦內NMDA受體和血管內皮生長因子蛋白表達的正向調節作用，該作用有利于SSF對VD的治療。

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